[发明专利]一种中国大豆花叶病毒侵染性克隆载体及其构建方法和应用

摘要

本发明公开了一种中国大豆花叶病毒侵染性克隆载体及其构建方法和应用。本发明通过分段酶切连接的方法将SMV中国株系SC3基因组构建至载体PBR322中，成功构建了SMV全长cDNA侵染性克隆载体，并将报告基因YFP插入到SMV基因组P1和Hc‑Pro之间，含报告基因YFP的侵染性克隆载体可以在荧光显微镜下直接观察大豆体内YFP的表达(绿色荧光)，从而确定SMV出现的位置和时间。本发明通过表型分析、RT‑PCR和ELISA等多种方法对SC3侵染性克隆载体的侵染活性进行检测，证明该载体在感病大豆品种南农1138‑2中具有侵染活性。该载体能够实现在DNA水平上开展RNA病毒SMV的相关研究。

主权项

1.一种中国大豆花叶病毒侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于包含以下步骤：(1)以中国大豆花叶病毒SC3的cDNA为模板，设计的SMV病毒基因组分段扩增引物A‑NotI、B‑KpnI、C‑KA、D‑AA、E‑AC，引物中引入酶切位点，利用高保真酶分段扩增SMV基因组；选择扩增引物对应的内切酶NotI、KpnI、AgeI、ApaI、ClaI分别酶切SMV病毒基因组扩增片段和载体骨架，并通过T4连接酶连接；采用此方法依次将SMV基因组的片段与载体骨架PBR322相连，使SMV病毒基因组完整的连接到载体骨架中，并修复载体中SMV基因组出现的碱基突变，获得SMV侵染性克隆载体PSMV:SC3；其中扩增引物A‑NotI上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物序列如SEQ ID NO.4所示；扩增引物B‑KpnI上游引物序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物序列如SEQ ID NO.6所示；扩增引物C‑KA上游引物序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物序列如SEQ ID NO.8所示；扩增引物D‑AA上游引物序列如SEQ ID NO.9所示，下游引物序列如SEQ ID NO.10所示；扩增引物E‑AC上游引物序列如SEQ ID NO.11所示，下游引物序列如SEQ ID NO.12所示；(2)利用引物MluI‑NotI和SmaI‑KpnI以载体PSMV:SC3为模板进行PCR扩增，在SC3病毒基因P1和Hc‑Pro处通过酶切连接的方法替换PSMV:SC3中的原有片段，并引入多克隆位点SmaI和MluI,于多克隆位点处插入外源蛋白YFP基因序列，构建成含荧光蛋白YFP的侵染性克隆载体PSMV:YFP；所述的引物MluI‑NotI上游引物序列如SEQ ID NO.21所示，下游引物序列如SEQ ID NO.22所示；扩增引物B‑KpnI上游引物序列如SEQ ID NO.23所示，下游引物序列如SEQ ID NO.24所示。