[发明专利]一种人粪便总DNA亚硫酸盐转化及回收纯化的方法

摘要

本发明提供一种人粪便总DNA亚硫酸盐转化及纯化的方法，采用热变性法95℃10‑20分钟后，立即冰置5‑10分钟防止复性，然后将DNA在75℃进行转化45‑60分钟，并采用磁珠法以及含PEG6000/8000的结合液对转化DNA进行纯化，能够得到高转化率、高质量的甲基化DNA，有利于甲基化检测的标准化及全自动化操作，用于后续粪便样本中人源DNA中基因的甲基化水平分析。

主权项

1.一种人粪便总DNA亚硫酸盐转化及回收纯化的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)在2.0mL离心管中加入1‑3000ug的待处理人粪便总DNA；(2)在步骤(1)离心管中加入100‑300μL亚硫酸盐转化溶液、30‑50μL保护溶液，盖紧离心管后，涡旋混匀，瞬时离心；(3)将步骤(2)离心管密闭置于恒温振荡孵育器中，95℃静置孵育10～20分钟；(4)立即将步骤(3)离心管取出，放置冰上5‑10分钟；(5)将步骤(4)离心管从冰上取出，颠倒混匀，瞬时离心，将离心管置于恒温振荡孵育器中，75℃静置孵育45‑60分钟；(6)瞬时离心步骤(5)反应后的离心管，向其中加入1000μL磁珠结合溶液、100‑200μL混匀的磁珠溶液，涡旋混匀，其中，磁珠预先混匀且室温平衡至少30分钟；(7)将步骤(6)离心管置于23℃的恒温振荡孵育器中，转速1000rpm，孵育45‑60分钟；(8)瞬时离心离心管后，将其置于磁力架2‑5分钟，待磁珠分离后，弃除上清液；(9)将步骤(8)离心管从磁力架上取下，加入800μL磁珠结合溶液；涡旋混匀重悬磁珠；重复步骤(8)；(10)将步骤(9)离心管从磁力架上取下，加入800μL洗涤液；涡旋混匀后重复步骤(8)；(11)将步骤(10)离心管从磁力架上取下，加入600μL洗涤液；涡旋混匀后重复步骤(8)；(12)瞬时离心步骤(11)离心管后，将其置于磁力架2‑5分钟，去除残留液体；(13)打开步骤(12)离心管的管盖，将离心管放置于恒温振荡孵育器中；23℃静置15分钟，等待磁珠干燥，静置时不要震荡；(14)向步骤(13)离心管加入35μL洗脱液；盖好离心管；涡旋混匀重悬磁珠；将离心管放入恒温振荡孵育器中，23℃，1000rpm，孵育10分钟；(15)瞬时离心步骤(14)离心管后，将其置于磁力架2‑5分钟，将洗脱液转移至新的无DNase无RNase酶的1.5mL离心管中；‑80℃保存备用。