[发明专利]阴沟肠杆菌blaNDM-1基因敲除的方法及应用

摘要

本发明公开一种阴沟肠杆菌bla_NDM‑1基因敲除的方法及应用，涉及基因工程技术领域。利用Red同源重组技术成功地将阴沟肠杆菌bla_NDM‑1基因敲除，通过PCR和测序验证bla_NDM‑1基因被成功敲除仅保留了1个FRT位点，进一步通过基因表达量验证阴沟肠杆菌的bla_NDM‑1基因表达量为对照菌株的1.2倍，说明此技术可用于阴沟肠杆菌的基因敲除与整合，同时验证了bla_NDM‑1基因敲除前后菌株生长趋势与生长速度无明显差异，对体外竞争力和耐药性有一定影响；为阴沟肠杆菌中其他基因功能的研究奠定基础。

主权项

1.一种阴沟肠杆菌blaNDM‑1基因敲除的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一、阴沟肠杆菌质粒抗性改造采用质粒小提取试剂盒对氨苄青霉素耐药的阴沟肠杆菌质粒提取，通过PCR扩增四环素抗性基因片段，并采用DNA纯化回收试剂盒纯化回收四环素抗性基因片段的PCR产物，将纯化的PCR产物进行酶切连接反应得到酶切连接产物，并将其转化人大肠埃希菌DH5α感受态细胞后进行酶切鉴定重组质粒；步骤二、Red重组系统依托质粒转化入阴沟肠杆菌采用超级感受态细胞制备试剂盒制备阴沟肠杆菌感受态细胞，将步骤一得到的重组质粒转化入制备的阴沟肠杆菌感受态细胞，对细菌基因组DNA进行提取得到阳性克隆阴沟肠杆菌；步骤三、同源重组片段的制备和纯化先通过PCR扩增同源重组片段，采用DNA纯化回收试剂盒纯化回收PCR产物，并进行DNA浓缩处理；步骤四、阴沟肠杆菌电击感受态细胞的制备及同源重组片段的电转化步骤五、PCR鉴定阴沟肠杆菌ΔNDM‑1∷Kn重组子步骤六、卡那霉素抗性基因的去除制备阴沟肠杆菌ΔNDM‑1∷Kn感受态细胞，将pCP20质粒转化入阴沟肠杆菌ΔNDM‑1∷Kn感受态细胞，过夜培养，隔天对单克隆菌落进行氯霉素和卡那霉素敏感检测，对其敏感的菌落为blaNDM‑1基因敲除的阴沟肠杆菌。