[发明专利]一种快速的水稻成熟胚原位转基因方法

摘要

本发明公开了一种快速的水稻成熟胚原位转基因方法，包括如下步骤：(1)水稻外植体的获得；(2)农杆菌侵染液制备；(3)侵染转化与共培养：用涂抹工具蘸取农杆菌侵染液，涂抹在步骤(1)的水稻胚芽生长点横切处，在穴盘中铺入配置好的生长基质，将涂抹后的水稻置于穴盘的生长基质上，再撒上一层生长基质，培养；(4)筛选，PCR检测：长高至5‑7cm后移栽至水田中生长，当小苗在水田中长出4‑7片新叶，用浓度为150‑180mg/L草甘膦水溶液喷洒叶片，筛选出有抗性的水稻植株，再PCR检测，鉴定得到成熟胚原位转基因阳性水稻。本发明的方法简单、快速、高效，转化率可达4％。

主权项

1.一种快速的水稻成熟胚原位转基因方法，其特征在于包括如下步骤：(1)水稻外植体的获得：挑取种皮完整且干燥的水稻成熟种子，在水中浸泡60‑72小时，取出，再浸入体积浓度为5％‑8％次氯酸钠水溶液中，放置15‑18分钟，用无菌水漂洗2‑4次；在容器中，铺无菌滤纸，将漂洗后的种子铺在无菌滤纸上，加入无菌水没过种子，于28‑30℃培养36‑48小时；挑选出带有1‑2cm胚芽的水稻个体，用灭菌的手术刀在胚芽生长点处横切；(2)农杆菌侵染液制备：在超净工作台用移液枪吸取‑80℃保存的含有目的基因Bar的农杆菌储存液200‑300μL，加入到2‑5mL灭菌的LB液体培养基中，置于25‑28℃摇床中，150‑200r/min，进行活化培养24‑28h，得到活化的农杆菌菌液；吸取1‑1.5mL活化的农杆菌菌液加入到25‑30mL灭菌的LB液体培养基中进行扩大培养，至OD600＝0.3‑0.4的扩大培养的菌液，取25‑30mL扩大培养的菌液置于灭菌的50mL离心管中，5000‑8000r/min，25‑28℃离心8‑10min，收集菌体，将菌体重悬于50‑100mL浓度为200‑250μM乙酰丁香酮水溶液中，得到农杆菌侵染液；(3)侵染转化与共培养：用涂抹工具蘸取农杆菌侵染液，涂抹在步骤(1)的水稻胚芽生长点横切处，在穴盘中铺入配置好的生长基质，将涂抹后的水稻置于穴盘的生长基质上，再撒上一层生长基质，28‑30℃培养；(4)筛选，PCR检测：长高至5‑7cm后移栽至水田中生长，当小苗在水田中长出4‑7片新叶，用浓度为150‑180mg/L草甘膦水溶液喷洒叶片，筛选出有抗性的水稻植株，再PCR检测，鉴定得到成熟胚原位转基因阳性水稻。