[发明专利]一种体外诱导扩增高杀伤活性γδT细胞的方法

摘要

本发明涉及一种体外诱导扩增γδT细胞的方法，属于生物技术领域。该方法首先是通过淋巴细胞分离液获得外周血单个核细胞(PBMCs)，然后利用含有唑来膦酸、IL‑2、IL‑7和IL‑15的无血清培养基进行刺激培养3天；再用含有IL‑2、IL‑7和IL‑15的无血清培养基进行刺激扩增培养；当培养至7‑9天时候，加入尼克酰胺(Nicotinamide)以提高γδT细胞的抗肿瘤活性。本发明无需对PBMCs进行纯化，在培养14天即可获得纯度在90％以上的γδT细胞；尼克酰胺的加入，明显提高了γδT细胞的抗肿瘤活性。本发明可以将γδT细胞扩增1500倍以上，能够满足临床对γδT细胞数量的要求。本发明操作步骤简单，可操作性强，具有很好的推广价值。

主权项

1.一种体外诱导扩增高杀伤活性γδT细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)制备PBMCs：取外周血，肝素抗凝，采用淋巴细胞分离液分离获得PBMCs，并用PBS缓冲液重悬洗涤细胞两次；(2)γδT细胞的刺激培养：向无血清培养基加入5‑10v％的自体血浆，同时按照每毫升无血清培养基加1μLγδT细胞刺激因子的计量加入γδT细胞刺激因子，得到γδT细胞刺激培养基，使用γδT细胞刺激培养基悬起PBMCs，并调整密度至1‑3×106个细胞/mL，接种于培养瓶中，并置于37℃、5％CO2的条件下培养；(3)制备γδT细胞扩增培养基：按照每毫升培养基加1μLγδT细胞扩增因子的计量，向无血清培养基中加入γδT细胞扩增因子，得到γδT细胞扩增培养基；(4)扩增培养：待步骤(2)中培养至第3d时，离心去除刺激培养基，使用γδT细胞扩增培养基将细胞密度调整到2‑3×106个细胞/mL，以后每2‑3d根据细胞密度补液，直至培养至第7‑9d，然后加入尼克酰胺，使其在培养基中的终浓度为2.5‑7.5mM，以后每2‑3d补加γδT细胞扩增培养基使细胞密度保持在2‑3×106个细胞/mL，并补加尼克酰胺，使其在培养基中的终浓度为2.5‑7.5mM；在37℃、5％CO2的条件下培养10‑14d，获得γδT细胞。