[发明专利]一种Nanos2在鸡ESCs向雄性生殖细胞分化过程中功能验证的方法在审

专利信息
申请号: 201810889239.7 申请日: 2018-08-07
公开(公告)号: CN109022484A 公开(公告)日: 2018-12-18
发明(设计)人: 张亚妮;张文慧;李碧春;王颖洁;王曼;程少泽;汪怡临;何娜娜 申请(专利权)人: 扬州大学
主分类号: C12N15/85 分类号: C12N15/85;C12N15/90;C12N9/22;G01N33/569
代理公司: 南京纵横知识产权代理有限公司 32224 代理人: 薛海霞;董建林
地址: 225009 *** 国省代码: 江苏;32
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摘要: 发明属于动物育种学和细胞生物学领域,具体涉及一种Nanos2在鸡ESCs向雄性生殖细胞分化过程中功能验证的方法,包括Nanos2在鸡不同组织中的表达量检测、Nanos2克隆与pcDNA3.0‑Nanos2载体的构建、Nanos2敲除载体构建及敲除活性验证、体外Nanos2功能验证、体内Nanos2功能验证、Quantitative Real Time PCR(quantitative RT‑PCR)验证、细胞形态学观察及细胞免疫化学检测、流式细胞分析、石蜡切片及PAS染色。相对于现有技术,能够较快地在鸡生殖细胞水平完成Nanos2的功能验证。方法简单易行,可重复性强,在普通实验室即可进行。该方法大大提高了体外诱导鸡ESCs向雄性生殖细胞分化的效率。该方法大大提高了体内诱导鸡PGCs和SSCs的生成效率。
搜索关键词: 功能验证 雄性生殖细胞 分化过程 敲除 生殖细胞 细胞生物学领域 细胞形态学观察 流式细胞分析 细胞免疫化学 表达量检测 动物育种 活性验证 可重复性 石蜡切片 体内诱导 体外诱导 载体构建 染色 构建 体外 克隆 体内 验证 分化 检测
【主权项】:
1. 一种Nanos2在鸡ESCs向雄性生殖细胞分化过程中功能验证的方法,其特征在于,利用qRT‑PCR检测成体公母鸡不同组织中Nanos2的表达情况,根据NCBI公布的鸡Nanos2序列设计引物,经PCR扩增出全长3411bp,构建过表达载体,同时根据PAM定位克隆的CDS序列,设计3个靶位点序列,并验证效率最高靶位点,构建Cas9/gRNA敲除载体,以DF‑1为试验材料验证敲除活性;在体内、外两个水平对Nanos2进行过表达和敲除;体外分离纯化第2代的鸡ESCs,结合无饲养层RA体外诱导体系,分别转染过表达载体pcDNA3.0‑Nanos2和敲除载体Nanos2‑g1,并设置对照组,每隔2天观察ESCs的形态变化;在整个诱导过程中,收集各组第0、4和10d的ESCs,qRT‑PCR检测相关基因表达变化;对诱导至4天和10天细胞进行间接免疫荧光检测标记蛋白CVH、ITGA6的表达情况;对诱导至第4天和第10天的细胞,分别标记CVH抗体和ITGA6抗体,经流式细胞分析检测不同处理组中阳性细胞率;体内验证,鸡胚正常发育至2.5天时,钝端以酒精消毒后开口,进行血管显微注射,至4.5天时观察鸡胚发育情况,在体式荧光倒置显微镜下观察荧光表达情况,对4.5日龄鸡胚石蜡切片进行PAS染色;分离出4.5d的生殖嵴和18d的睾丸组织,qRT‑PCR检测目的基因Nanos2以及生殖相关基因cvh、c‑kit、integrin α6的表达变化,同时,分离出PGCs和SSCs,以CVH和ITGA6抗体标记,通过流式细胞分析检测各组中阳性生殖细胞比例的变化。
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