[发明专利]一种基于CYP2C19基因的荧光定量PCR检测方法在审
申请号: | 201810896012.5 | 申请日: | 2018-08-08 |
公开(公告)号: | CN109295195A | 公开(公告)日: | 2019-02-01 |
发明(设计)人: | 程世亮 | 申请(专利权)人: | 济南齐鲁医学检验有限公司 |
主分类号: | C12Q1/6883 | 分类号: | C12Q1/6883;C12Q1/686 |
代理公司: | 暂无信息 | 代理人: | 暂无信息 |
地址: | 250000 山东省济南市*** | 国省代码: | 山东;37 |
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摘要: | 本发明涉及一种基于CYP2C19基因的荧光定量PCR检测方法,包括以下步骤:称取10ng~20ng的CYP2C19基因组DNA,加入2μl~4μl的10×Taq DNA聚合酶,加入0.4μl~0.8μl的DNA聚合酶,然后加入的尿嘧啶N糖基化酶,脱氧核糖核苷三磷酸和Mg2+水溶液,量取2μl~4μl的甘油、0.05μl~0.1μl的下游引物、0.05μl~0.1μl的下游引物、0.1μl~0.2μl的681G探针、0.1μl~0.2μl的681A探针,加入至上述混合液体内,加入适量的双蒸水。结果判定:通过△Ct、CtV和CtF具体值,确定携带被检测基因的人群对药物的反应是慢代谢型、快代谢型或者中间代谢型。有益效果:不需要针对每种基因型设置一个PCR反应,操作简便;适用于两通道荧光定量PCR仪,具有特异、灵敏、快速、操作方便等优点。 | ||
搜索关键词: | 荧光定量PCR检测 下游引物 代谢型 探针 脱氧核糖核苷三磷酸 基因组DNA 混合液体 结果判定 通道荧光 中间代谢 定量PCR 甘油 基因型 尿嘧啶 双蒸水 称取 量取 灵敏 携带 基因 检测 人群 | ||
【主权项】:
1.一种基于CYP2C19基因的荧光定量PCR检测方法,其特征在于:包括以下步骤:(1)称取10ng~20ng的CYP2C19基因组DNA,加入2μl~4μl的10×Taq DNA聚合酶(不含Mg2+),手动剧烈振荡管体10S~15S后,加入0.4μl~0.8μl的DNA聚合酶,置于15℃~30℃孵育2min~3min,然后加入0.2μl~0.4μl的尿嘧啶N糖基化酶,在0℃~4℃的环境下,震动混合15min~30min;量取0.1μl~0.2μl的脱氧核糖核苷三磷酸和0.2μl~0.4μl的Mg2+水溶液,混合均匀后,加入至上述混合液体内,手动剧烈振荡管体10S~15S后,将混合液体在60℃~70℃金属浴3min~5min;量取2μl~4μl的甘油、0.05μl~0.1μl的下游引物、0.05μl~0.1μl的下游引物、0.1μl~0.2μl的681G探针、0.1μl~0.2μl的681A探针,加入至上述混合液体内,轻摇溶液10S~15S,并置于离心机中6000rpm短暂离心10S~30S;将经过离心的混合液在60℃~70℃金属浴3min~5min,取出后立即冰水浴至室温,然后加入适量的双蒸水,直至混合液体达到40μl,即获得CYP2C19的PCR反应溶液;(2)将步骤(1)中获得CYP2C19的PCR反应溶液置于反应管放入荧光定量PCR仪器中,收集60℃时的荧光信号;(3)结果判定:记录每个检测FAM通道的Ct值(记为CtF)和VIC通道的Ct值(记为CtV),计算Ct差值的绝对值△Ct=|CtF-CtV|;若△Ct<3.0,该位点判断为杂合突变型;若△Ct>3.0,分两种情况判断:当CtF<CtV时,该位点判断为纯合野生型;当CtV<CtF时,该位点判断为纯合突变型;并通过△Ct、CtV和CtF具体值,确定被检测CYP2C19的基因多态性情况,从而确定携带被检测基因的人群对药物的反应是慢代谢型、快代谢型或者中间代谢型。
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