[发明专利]一种三维矿化胶原支架材料及其骨再生应用

摘要

本发明公开了一种三维矿化胶原支架材料及其骨再生应用，通过二元组装制备具严格等级结构的三维矿化胶原支架材料的方法分为两步：首先制备纳米羟基磷灰石；在胶原矿化过程中通过透析缓慢进入并沉积于胶原纤维表面；在体外通过各项参数的控制完成对天然骨矿化胶原纤维的模拟；再完全复制天然骨化学成分及周期性等级结构的前提下，三维矿化胶原支架具有合适的机械强度，能够招募宿主细胞实现成骨分化。具严格等级结构的三维矿化胶原支架材料还具备优良的成血管能力，不加任何生物制剂如成骨因子或重组蛋白的情况下，单独利用三维多孔胶原支架材料实现活体动物试验中骨缺损的修复。

主权项

1.一种三维矿化胶原支架材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)I型胶原的提取：称取1kg的牛肌腱用碎肉机切碎并清洗过后，加入大量的丙酮浸泡1天去除表面脂肪组织；常温干燥后加入2L的0.5M的乙酸溶液在4℃下搅拌1天，向体系中加入100g的胃蛋白酶继续搅拌2天并不断补充新的乙酸溶液直至总体积为5L；将混合物用纱布粗滤，得到的滤液为胶原粗提物；在粗提物中加入NaCl进行盐析，分离出沉淀再用0.5M的乙酸溶液溶解，反复三次后将所得溶液置于透析袋中进行透析，最后冷冻干燥得到高纯I型胶原；2)纳米羟基磷灰石的制备：将66mg的CaCl2·2H2O及25mg的聚丙烯酸溶于50mL的TBS缓冲液中得到A液；将48mg的K2HPO4·3H2O加入到50mL的TBS缓冲液中得到B液；在40℃水浴中将A液逐滴滴加到B液中；反应完成后在该混合液中加入大量无水乙醇，8000～12000r/min离心5～10分钟，去掉上清液，在羟基磷灰石沉淀中加入50mL的灭菌PBS溶液，使其pH＝7.4，震荡使其完全溶解；3)胶原矿化：取一定量的I型胶原溶于0.5M的乙酸溶液中，并放入截留分子量为10000的透析袋中，并将透析袋置于步骤2)所得的羟基磷灰石的PBS溶液中；在湿润的环境中于37℃下透析六天，每三天换一次羟基磷灰石的PBS溶液，随后在去离子水中透析三天进行清洗去掉多余的盐，每天换一次水；4)三维多孔框架的合成：将步骤3)得到的矿化胶原离心、搅拌形成一种可铸形的悬浮液，注入到圆柱形或长方形的模具中冷冻干燥得到三维海绵状的胶原支架；为确保稳定的微环境，再使用重量比1％的1‑乙基(3‑二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐在80％的乙醇中进一步交联4小时，随后用甘氨酸溶液与去离子水交替冲洗，冻干，即得到具严格等级结构的三维矿化胶原支架。