[发明专利]一种分析羊毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法

摘要

本发明涉及羊毛检测技术领域，公开了一种分析羊毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法。本发明先采用中性洗毛的工艺去除羊毛的油脂、杂质，将羊毛分成12等份，然后采用排列组合的方法用不同蛋白酶对羊毛由外向内逐层酶解，对于仅用过酸性蛋白酶酶解的羊毛用三(2‑羧乙基)膦特异地断裂二硫键，先对未断二硫键的各组羊毛进行氨基酸分析，得到氨基酸的径向分布，再对比断裂二硫键前后的组别，得到羊毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布。本发明根据羊毛角蛋白中氨基酸分布具有不同层次的特点，采用排列组合的多次酶解法对角蛋白进行溶解，对氨基酸的破坏小，准确性高，特异性强，方法较为环保。

主权项

1.一种分析羊毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法，其特征在于包括以下步骤：1）称取羊毛作为样品，用去离子水反复搓洗，去除表面杂质，烘干；2）将烘干的样品在50‑60℃下，以1:95‑105的浴比在含有0.06‑0.08wt%十二烷醇聚氧乙烯醚和0.2‑0.4wt%硫酸钠的混合溶液中煮25‑35min，洗除油脂、杂质，重复一次；3）洗除油脂之后，将样品用去离子水冲洗干净，在40‑50℃干燥，得到烘干的羊毛；4）将步骤3）烘干的羊毛分成A1、A2、B1、B2、C1、C2、D、E、F1、F2、G、H等质量份的12组，其中A1组作为对照组，不做任何处理；将A2放入三口烧瓶中，在45‑55℃下，以1:18‑22的浴比在pH=4‑6的0.7‑0.8mol/L 三(2‑羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25‑35min，然后在40‑50℃下，以1:18‑20的浴比在2‑4owf%乙撑亚胺中反应25‑35min；5）将B1、B2、C1、C2、D、E组浸入到胃蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留B1组残余羊毛；将B2放入三口烧瓶中，在45‑55℃下，以1:18‑22的浴比在pH=4‑6的0.7‑0.8mol/L 三(2‑羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25‑35min，然后在40‑50℃下，以1:18‑20的浴比在2‑4owf%乙撑亚胺中反应25‑35min；6）将步骤5）酶解过的C1、C2、D、E组浸入到菠萝蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留C1组残余羊毛；将C2放入三口烧瓶中，在45‑55℃下，以1:18‑22的浴比在pH=4‑6的0.7‑0.8mol/L 三(2‑羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25‑35min，然后在40‑50℃下，以1:18‑20的浴比在2‑4owf%乙撑亚胺中反应25‑35min；7）将步骤6）酶解过的D、E组浸入到胰蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留D组残余羊毛；8）将步骤7）酶解过的E组浸入到葡萄球菌蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理；9）将F1、F2、G、H组浸入到菠萝蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留F1组残余羊毛；将F2放入三口烧瓶中，在45‑55℃下，以1:18‑22的浴比在pH=4‑6的0.7‑0.8mol/L 三(2‑羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25‑35min，然后在40‑50℃下，以1:18‑20的浴比在2‑4owf%乙撑亚胺中反应25‑35min；10）将步骤9）酶解过的G、H组浸入到葡萄球菌蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留G组残余羊毛；11）将步骤10）酶解过的H组浸入到胰蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理；12）对A2、B1、B2、C1、C2、D、E、F1、F2、G、H组酶解后所得残余羊毛进行过滤和洗涤处理，得到在径向上具有不同程度溶蚀的残余羊毛；13）利用全自动氨基酸分析仪对以上各组残余羊毛进行氨基酸分析，对比A1、B1、C1、D、E、F1、G、H，分析羊毛角蛋白中氨基酸的径向分布；14）在分析出羊毛角蛋白中氨基酸的径向分布的前提下，对比A1和A2、B1和B2、C1和C2、F1和F2，分析羊毛角蛋白中氨基酸的键合折叠分布。