[发明专利]一种快速挖掘并测定白酒酿造过程中腺苷甲硫氨酸的方法

摘要

本发明涉及白酒发酵功能因子挖掘分析技术领域，尤其涉及用于白酒发酵产物，包括大曲、酒醅、酒糟中腺苷甲硫氨酸的挖掘及其含量的测定。其具体步骤为：挖掘白酒酿造过程中腺苷甲硫氨酸的存在及其表达和测定白酒酿造过程中的腺苷甲硫氨酸的含量。本发明的优点是：操作简便快速、劳动强度小、有机溶剂用量少、准确度高、定量准确等特点，适用于发掘白酒发酵过程中的健康因子及腺苷甲硫氨酸的定性及定量分析。

主权项

1.一种快速挖掘并测定白酒酿造过程中腺苷甲硫氨酸的方法，具体包括以下步骤：（1）挖掘白酒酿造过程中腺苷甲硫氨酸的存在及其表达：1）高通量测序：对待测样品白酒发酵产物用Illumina Mi Seq PE300 (Illumina，California，USA)进行高通量测序；2）转录组测序：对白酒发酵产物提取RNA，并用Hiseq2000对RNA进行测序；3）基因表达分析：使用软件Cuff links对步骤2）测序后的RNA进行基因表达分析，确定白酒发酵过程中产生的对应风味物质（腺苷甲硫氨酸）的菌种；（2）测定白酒酿造过程中的腺苷甲硫氨酸：1）浸泡与超声提取：取5～10g白酒发酵产物，加入15～20ml的超纯水，浸泡10～30min后，超声提取 2～3次，每次≥20min，12000rpm离心10～15min后取上清液备用；2）固相萃取柱浓缩纯化：向oasis HLB萃取小柱加入2ml甲醇活化固相萃取柱，再加入1ml超纯水平衡萃取柱；加入步骤1）所得样品上清液，静置10min后加入2ml甲醇洗脱，再加入 1ml流动相洗脱，并收集0.8ml处流出液；过0.22μm滤膜于液相小瓶中待LC‑MS检测备用；3）腺苷甲硫氨酸含量的测定：物质定性采用离子碎片进行分析比对，并以标准品作为对照；定量方法采用将待测物质丰度与标准品比对；4）LC‑MS检测：a、仪器：Agilent 6520 Accurate‑Mass QTOF LC‑MS，ESI+离子源 (Agilent Technologies) ；b、色谱柱：Kromasil C18 column，4.6×250 mm ；c、液相条件：柱温：25～35℃；d、流动相 ：A相：甲醇，B相：水（含0.1%甲酸）B相：A相=(95:5，v/v)；f、流速：0.8 mL/ming、进样量：10μl；5）标准曲线的建立：a、配制标准品母液：称取1mg腺苷甲硫氨酸物标准品，用超纯水配制成1mg/ml 的标准品母液，随后梯度稀释成12.5μg/ml、25μg /ml、50μg/ml、100μg /ml、125μg/ml标品溶液放置于4℃冰箱中保存备用； b、绘制标准曲线：以腺苷甲硫氨酸标准品特征离子峰的峰面积作为纵坐标，以腺苷甲硫氨酸标准品稀释液浓度作为横坐标绘制标准曲线；6）腺苷甲硫氨酸含量计算：通过步骤5）标准曲线计算白酒发酵产物中腺苷甲硫氨酸含量。