[发明专利]一种在低氧环境中从胎盘中获取造血干细胞的方法

摘要

本发明涉及造血干细胞的获取方法技术领域，尤其涉及一种在低氧环境中从胎盘中获取造血干细胞的方法。本发明获取胎盘中造血干细胞的过程全部在一个模拟生物体内的正常低氧环境条件下完成；在获取造血干细胞的过程中所使用的消化液为包括胶原酶、分散酶、DNA酶1和胎牛血清的混合液。采用本发明从胎盘中获取造血干细胞的方法，克服了因短暂高氧造成的非生理氧压应激的问题，获得的造血干细胞数量多、状态原始，且在体外有良好的增殖和分化能力。

主权项

1.一种在低氧环境中从胎盘中获取造血干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，胎盘采集：使用脐带夹夹住胎盘中的脐带末端，将胎盘立刻放入盛有足量组织保护液的无菌采样袋中，确保胎盘全部没入该组织保护液中，排除多余空气，封好无菌采样袋，立即于低温环境下运输至实验室，所述低温环境的温度要求为：2‑24℃；步骤2，胎盘预处理：在无菌低氧环境下，将胎盘从无菌采样袋中取出，用75％酒精擦拭胎盘组织表面，再用无菌生理盐水将胎盘组织上残留的组织保护液清洗干净，去除死细胞和血凝块，移除羊膜和蜕膜等组织，剪去步骤1中用脐带夹夹住的那端的部分脐带，胎盘上余留下的脐带长度为5‑6cm，用无菌处理过的脐带夹夹住所述余留下的脐带末端，防止脐带血流失；步骤3，获取脐带血：在无菌低氧环境下，松开脐带末端的脐带夹，将脐带末端放入50ml离心管中，挤压胎盘，将脐血挤到离心管中，再将脐血从离心管转移至无菌血袋中，待从中获取造血干细胞；步骤4，胎盘灌注：在无菌低氧环境下，再次用无菌处理过的脐带夹夹住脐带末端，将灌注液1注射至脐带静脉或者动脉中，注射的同时摇晃胎盘，使得灌注液1进入胎盘血管网络，随后将脐带末端放入50ml离心管，挤压胎盘，从脐带末端流入离心管中的混合液体即为收集液1；重复此注射收集操作5‑10次，直至胎盘胎儿面发白，汇集收集液1；步骤5，胎盘再灌注：在无菌低氧环境下，将灌注液2注射入脐动脉或者脐静脉中，注射得灌注液2为20‑50ml，用无菌处理过的脐带夹夹住脐带末端，再将所述胎盘放入玻璃皿中，低氧环境中，37℃孵育1h；步骤6，脐血单个核细胞分离：在无菌低氧环境下，步骤5中在灌注液2注射入胎盘的脐动脉或者脐静脉操作时，注射的同时摇晃胎盘，使得灌注液2进入胎盘血管网络，随后将脐带末端放入离心管内，挤压胎盘，从脐带末端流入离心管中的混合液体即为收集液2；所述注射收集操作重复2次，汇集收集液2；将收集液2与步骤4中获取的收集液1混合，在200g离心力、4℃条件下，离心10min；保留沉淀，用磷酸缓冲液重悬后，形成重悬液，再加入人淋巴细胞分离液，重悬液体积与人淋巴细胞分离液体积之比为3：4‑3：5，低氧环境中进行离心，在相对离心力800g，温度20℃条件下，离心20min；收集沉淀即为单个核细胞1，即为脐血单个核细胞；步骤7，绒毛组织消化：在无菌低氧环境下，将胎盘绒毛物理分割至0.1‑0.2mm3大小，300目筛网过滤组织碎块，过滤时不断添加组织保护液，去除红细胞；收集滤渣，将所述滤渣分装于离心管中，每个离心管中的滤渣体积为17‑23ml，再加入消化液，其中滤渣与消化液的体积比为2:3；将离心管置于低氧环境中，37℃孵育1.5h；步骤8，胎盘单个核细胞分离：在无菌低氧环境下，将步骤7中的滤渣与消化液的混合物，于300目筛网过滤，过滤的同时加入组织保护液，将滤液收集后离心，得到沉淀，汇集沉淀，加入组织保护液重悬，形成重悬液，再加入人淋巴细胞分离液，人淋巴细胞分离液与重悬液体积之比为4：3，在低氧环境中进行离心，在离心力800g，温度20℃条件下，离心20min；收集沉淀，即为单个核细胞2，即为胎盘单个核细胞；步骤9，汇集单个核细胞1和单个核细胞2，形成总胎盘单个核细胞，即获得造血干细胞。