[发明专利]一种全长转录因子酵母双杂交文库的构建方法

摘要

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种酵母双杂交文库构建方法专利申请事宜。该方法用于烟草基因组全长转录因子文库构建，具体包括：转录因子筛选及开放阅读框全长扩增引物设计、制备cDNA模板、PCR扩增、磷酸化处理、连接重组接头、构建全长转录因子的文库质粒、质粒转化并构建文库等步骤。本申请所提供全长转录因子酵母双杂交文库构建方法，是对现有构建方法的进一步综合性改进，具有转录因子阳性筛选率高、筛选准确性高、所构建文库质量高等优点，同时由于对于相关操作步骤有所优化，因而能够节省构建时间和构建成本，因此具有较好的实用价值和推广应用意义。

主权项

1.一种全长转录因子酵母双杂交文库的构建方法，其特征在于，该方法用于烟草基因组全长转录因子文库构建，该方法具体包括下述步骤：（1）转录因子筛选及开放阅读框全长扩增引物设计依据目的作物烟草基因组信息，筛选全长转录因子及对其对应的全长开放阅读框设计PCR扩增用引物；全长转录因子的具体筛选原则及操作步骤如下：第一，从基因组中预测的转录因子中去除ORF不完整的转录因子；第二，筛选出至少在一种组织或其器官中表达的转录因子；第三，将高度相似的转录因子进行聚类，得到非冗余的转录因子基因集；第四，设计引物，并基于基因组数据，对获得的转录因子引物进行ePCR分析，筛选产物唯一的转录因子，作为建库用转录因子；最后，基于上述操作，最终获得全长转录因子；（2）制备cDNA模板提取目的作物样品的总RNA，并反转录合成第一链cDNA；（3）PCR扩增利用平末端DNA聚合酶进行PCR扩增，获得全长转录因子的全长开放阅读框；（4）磷酸化处理对步骤（3）的PCR扩增产物进行5' 端磷酸化；（5）连接重组接头将步骤（4）中5' 端磷酸化后的PCR扩增产物连接重组接头；（6）构建全长转录因子的文库质粒将步骤（5）中连接有重组接头的5' 端磷酸化PCR扩增产物与酵母双杂交载体进行重组连接，构建获得全长转录因子的文库质粒；（7）质粒转化并构建文库将步骤（6）中所构建全长转录因子文库质粒转化、筛选，获得全长转录因子酵母双杂交文库。