[发明专利]一种凝胶培养基中β-内酰胺酶的酶活力定量检测方法

摘要

本发明公开了一种定量检测凝胶培养基中β‑内酰胺酶酶活力的测定方法，通过特别浆化处理方法将凝胶培养基制成澄明溶液，再利用羟胺与β‑内酰胺类抗生素生成青霉酰羟肟酸，羟肟酸与铁离子(Fe³⁺)生成棕红色化合物的显色原理，通过测定未被β‑内酰胺酶分解的青霉素含量来定量测定凝胶培养基中的β‑内酰胺酶活力。根据本发明的测定方法，凝胶培养基(处理液)中β‑内酰胺酶检出限为46u/g(ml)，样品溶液的定量线性范围为0U/ml～2000U/ml。

主权项

1.一种凝胶培养基中β‑内酰胺酶的酶活力定量检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：1)采用明确效价单位数的青霉素G钠标准品用PH7.0的磷酸盐缓冲溶液精确配制不同浓度的青霉素G钠标准品溶液(mg/ml)，浓度范围从0～6mg/ml。2)取各不同浓度的青霉素G钠标准品溶液1ml，加入中性羟胺(pH 6.75)1ml、95％乙醇1ml，反应3min，再加入硫酸铁胺溶液2ml，混匀&显色，待反应气泡消失后，测定OD515值即A值。3)以青霉素G钠浓度或单位数为横坐标，以OD515值即A值为纵坐标，绘制标准曲线(图)，得到回归方程y＝ax+b，R2≥0.999。4)精密称取含酶凝胶培养基(0.01g)，加入PH7.0的磷酸盐缓冲液浆化(酶解)制成澄明溶液，作为样品处理液。必要时于37±1℃保温1小时使样品溶液澄清。5)将含酶平皿培养基的样品处理液用PH7.0的磷酸盐缓冲溶液按“1、2、3、4、5......倍数稀释”，即得样品稀释液。样品处理液若不稀释，稀释倍数＝1。6)按样品处理液或样品稀释液的估计酶活力单位数，取适量体积(ml)的样品溶液于三角瓶中，按“1∶1.5～5.0”比例加入适量青霉素G钠标准品溶液，定容至20‑30ml体积，得样品反应保温混合液，于37±1℃保温计时。7)参照步骤2.方法操作，于保温“0”hr时取1ml样品保温反应混合液，加入各反应溶液，混匀&显色，待反应气泡消失后，测定OD515值即A0样。其余样品保温混合液于37±1℃保温计时1hr，于“1”hr时取1ml样品保温反应混合液，测定OD515值即A1样。8)样品溶液检测时须做阴性对照测定，测定得到A0阴和A1阴。9)依据测定结果，计算反应液的酶活，最终计算出每克培养基所含酶活力单位数。