[发明专利]一种适用于单细胞真核藻类基因组大小的测定方法

摘要

本发明公开一种适用于单细胞真核藻类基因组大小的测定方法。本发明基于单细胞真核藻类的特性，优化了细胞核的提取与染色方法，获得了较为准确的流式细胞分析结果，并与高通量二代illumina测序技术相结合，综合评估藻细胞的基因组大小，明确基因组的特征。该技术方法优化了传统植物流式细胞分析，利用甲醇去除了藻细胞色素和细胞壁的干扰，大大的提高了PI的染色效果，提高了流式细胞分析的准确性，同时结合目前较为前沿的高通量测序技术，综合分析了待测物种基因组结构特征，可为后续物种的遗传结构研究和全基因组测序的组装策略的制定提供理论依据。

主权项

1.一种适用于单细胞真核藻类基因组大小的测定方法，其特征在于包括如下步骤：(1)材料准备：单细胞真核藻类无菌培养物，离心去上清，再用无菌水漂洗2～3次，去除培养基成分，获得藻细胞；(2)内参选择：仪器调试后进行样品荧光强度及基因组大小的预测，根据预测基因组大小选择莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)为主要内参，眼点拟纳绿球藻(Nannochlropsis oculata)和/或盐生拟微绿球藻(Microchloropsis salina)为第二内参，并依据内参基因组大小进行相互校正；(3)细胞壁破坏及色素的去除：待测藻类和内参藻类，按照每105个藻细胞加入1～2mL甲醇的量；将甲醇分别加入到待测藻类和内参藻类的藻细胞中，常温下磁力搅拌破坏细胞壁及叶绿体结构去除叶绿素的干扰，每次1～2h，离心去上清，重复提取3～5次，直到细胞变为白色；然后按照每105个藻细胞加入0.1～0.2mL Lysis buffer LB01重悬细胞，于冰上裂解处理，获得细胞核悬浮液；(4)藻细胞核染色：按照1mL细胞核悬浮液加入50μg PI、50μg RNase和5μLβ‑巯基乙醇的量，混匀后避光染色，之后取细胞核悬浮液进行流式细胞仪分析测定待测藻类和内参藻类的荧光值，计算待测藻类基因组大小。