[发明专利]一种猪凝血酶的制备方法在审
申请号: | 201811040796.8 | 申请日: | 2018-09-07 |
公开(公告)号: | CN109182315A | 公开(公告)日: | 2019-01-11 |
发明(设计)人: | 刘骞 | 申请(专利权)人: | 无锡凯夫制药有限公司 |
主分类号: | C12N9/74 | 分类号: | C12N9/74 |
代理公司: | 连云港联创专利代理事务所(特殊普通合伙) 32330 | 代理人: | 刘刚 |
地址: | 214000 *** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | 本发明公开了一种猪凝血酶的制备方法,包括以下步骤:1)血浆的制备、2)S/D法病毒灭活、3)凝血酶原粗品制备、4)凝血酶激活液制备、5)凝血酶纯化、6)超滤脱盐、7)纳米膜除病毒;本发明通过到工艺过程中的两步联合病毒灭活步骤,有效的控制了终产品中的病毒含量,提高了凝血酶的安全性;通过Marker电泳确认(图2),两步纯化明显提高了凝血酶的纯度,同时控制了S/D的残留,提高了纳滤膜除病毒的效率。 | ||
搜索关键词: | 制备 凝血酶 病毒 种猪 凝血酶纯化 凝血酶激活 电泳 病毒灭活 工艺过程 两步纯化 凝血酶原 纳滤膜 纳米膜 超滤 粗品 脱盐 血浆 残留 联合 | ||
【主权项】:
1.一种猪凝血酶的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:1)血浆的制备向收集的新鲜猪血中加入柠檬酸钠溶液,15℃以下,离心分离血红细胞和血浆,所得血浆置于‑20℃冻存;2)S/D法病毒灭活将经过室温解冻的血浆用定性滤纸过滤,所得滤液加入曲拉通X‑100和磷酸三丁酯,搅拌3~6小时;3)凝血酶原粗品制备将经过S/D灭活处理的血浆用定性滤纸过滤,所得滤液中加入DEAE Sephadex A‑50凝胶,搅拌;过滤,弃去滤液;配置0.01~0.1moL/L的柠檬酸钠、0.05~0.8moL/L氯化钠溶液的高盐洗涤液,先用高盐溶液淋洗凝胶除去杂蛋白;再用高盐溶液洗脱液浸泡凝胶10~20分钟,过滤,重复三次或三次以上,收集滤液;4)凝血酶激活液制备向上述滤液中加入氯化钙溶液,调整滤液中Ca+的浓度最终调节为0.02~0.15moL/L,25℃~32℃搅拌激活0.5小时;5)凝血酶纯化以Sp‑Sepharose FF填充的柱子,将上述凝血酶激活液按1:3~6的比例用柠檬酸钠溶液稀释,上样;上样完毕后用高盐洗涤液淋洗≥3个柱体积,洗涤杂蛋白;再用高盐洗涤液洗脱2个柱体积,收集凝血酶纯品;6)超滤脱盐将上述收集液进行超滤脱盐;7)纳米膜除病毒将DV20NI0552纳滤膜正确安装后,给储液罐中的超滤浓缩液加压,维持滤膜前后的压差在2~5bar,过滤超滤浓缩液,得到凝血酶溶液。
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