[发明专利]一种转基因鸡输卵管生物反应器的制备方法

摘要

本发明提出了一种转基因鸡输卵管生物反应器的制备方法，包括以下步骤：S1.设计靶向鸡基因组DNA的gRNA；S2.构建gRNA的表达载体；S3.构建携带有外源基因表达框的供体载体：所述供体载体包括同源修复载体和非同源修复载体；S4.将载体导入鸡个体。本发明利用结合CRISPR基因编辑技术，提高了外源基因整合到基因组中的准确率，实现高效率导入外源基因，制备出能够表达并分泌外源蛋白到鸡蛋蛋清中的转基因鸡，并实现外源基因稳定的遗传给后代。

主权项

1.一种转基因鸡输卵管生物反应器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.设计靶向鸡基因组DNA的gRNA：选用的鸡基因组目标DNA序列为卵清蛋白第一内含子，根据不同种类Cas9蛋白的不同PAM序列规则，选择同源性90％以上的gRNA；S2.构建gRNA的表达载体：根据PAM规则确定靶位点序列后，合成符合表达载体构建要求的靶位点序列正负DNA单链，退火形成DNA双链之后连接到CRISPR/Cas系统表达载体上，载体导入细胞后能表达gRNA和Cas蛋白；S3.构建携带有外源基因表达框的供体载体：所述供体载体包括同源修复载体和非同源修复载体；S31.构建所述同源修复的供体载体：以单链DNA作为同源重组修复模板，上下同源序列以45bp‑90bp；或以双链DNA作为同源重组修复模板，将目标DNA位点DSB处上游和下游各100bp‑1000bp序列，分别连接在外源基因的5'端和3'端，作为同源臂，供体载体可以以闭环质粒或者PCR产物或者线性DNA的形式存在；S32.构建所述非同源修复的供体载体：PAM序列和靶位点序列组成一个切割位点框，切割位点框的反向互补序列为反向互补切割位点框，在供体载体中存在一个或者两个反向互补切割位点框，以闭环质粒或线性DNA的形式存在；S4.将载体导入鸡个体：将步骤S2中制备好的任意gRNA/Cas9组合，和步骤S3中制备好的供体载体混合均匀后，注射到处于鸡胚发育X期的受精蛋中的胚盘下腔，随后对注射后的鸡胚进行电穿孔操作；或将步骤S2中制备好的任意gRNA/Cas9组合，和步骤S3中制备好的供体载体混合均匀后，将质粒混合液与核酸转染试剂按比例混合，之后注射到X期的鸡胚受精蛋中；随后孵化直至出雏。