[发明专利]含HSV-TK基因且CTLA4基因缺陷型人造血干细胞的制备方法

摘要

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种含HSV‑TK基因且CTLA4基因缺陷型人造血干细胞的制备方法。人造血干细胞CD34+分离与培养，含HSV‑TK基因人造血干细胞CD34+的获得，CTLA4基因敲除载体构建，电转染人造血干细胞，流式细胞仪筛选与测序分析。本发明制备的含有自杀基因HSV‑TK且CTLA4基因缺陷型人造血干细胞为进一步研究造血干细胞分化成CTLA4缺陷型T淋巴细胞用于长期肿瘤免疫提供了基础；同时肿瘤在机体内消失后，患者服用丙氧鸟苷就可以清除该类造血干细胞和已分化产生的T淋巴细胞，使机体恢复正常状态。

主权项

1.一种含HSV‑TK基因且CTLA4基因缺陷型人造血干细胞的制备方法，其特征在于步骤如下：(1)人造血干细胞CD34+分离与培养人造血干细胞CD34+分离，纯化，培养；(2)含HSV‑TK基因人造血干细胞CD34+的获得根据HSV‑TK全基因编码区序列人工合成HSV‑TK基因，而后构建慢病毒质粒载体，慢病毒质粒载体与包装质粒共转染293T细胞获得HSV‑TK慢病毒；然后HSV‑TK慢病毒侵染人造血干细胞CD34+，筛选获得含HSV‑TK基因的人造血干细胞CD34+；(3)CTLA4基因敲除载体构建根据CTLA4基因编码序列设计gRNA target序列，然后将gRNA target序列克隆进表达载体，获得CTLA4基因的敲除载体；gRNA target序列为5’‑ATGCCCAGGTAGTATGGCGG‑3；(4)电转染人造血干细胞含HSV‑TK基因的人造血干细胞CD34+中加入电转液和CTLA4基因的敲除载体进行电转染，电转染结束后，继续培养；(5)流式细胞仪筛选与测序分析电转染结束后收集的细胞采用流式细胞仪进行分离得到单克隆细胞，单克隆细胞扩大培养，即得含HSV‑TK基因且CTLA4基因缺陷型人造血干细胞；扩大培养后的单克隆细胞提取基因组进行测序比对分析。