[发明专利]一种高产维生素B12的突变菌株制备方法

摘要

本发明属于生物工程中的菌种制备技术领域，涉及一株高产维生素B12成分的突变菌株及工业发酵技术,特别是一种高产维生素的突变菌株的生产培育方法；涉及的脱氮假单胞菌的具体诱变工艺步骤包括：出发菌悬液制备、诱变、菌落计数、菌株初筛和菌株复筛；其通过对原始菌株进行诱变后，再次通过常温常压等离子体（ARTP）诱变技术对一株具有典型诱变特征的菌株进行了诱变，最终获得遗传性质稳定、发酵水平较高的菌种；涉及的突变菌株TP‑121实现工业发酵生产维生素B12的方法包括如下步骤：种瓶制备、种子罐培养和发酵罐培养；其工艺原理可靠，操作步骤简单，技术条件成熟，菌种优质，维生素产量高，应用环境友好。

主权项

1.一种高产维生素B12的突变菌株制备方法，其特征在于涉及的脱氮假单胞菌的具体诱变工艺步骤如下：（1）出发菌悬液制备：取两株出发菌株的新鲜斜面，用无菌水洗脱菌体，在有玻璃珠的试管振荡使菌体分散，离心收集菌体，以5％甘油重悬菌体，以血球计数板计数直至菌浓为107‑108个/mL，制得出发菌悬液；（2）诱变：开启常温常压等离子出发系统，以酒精棉擦拭操作室内外空间，并开启紫外灯灭菌30min，灭菌结束后取10μL菌悬液点于载片的粗糙面，并在无菌条件下将载片以镊子转移至操作室台面上；开启氦气阀门，设定气流量和诱变时间进行诱变；诱变时间分别设定为90s、120s、150s、180s、210s；（3）菌落计数：每次诱变结束后均将载片置于含990μL无菌生理盐水的EP管中，漩涡震荡1min；稀释涂布后置于30+2℃，50+5%相对湿度下培养5天，对长出的单菌落进行观察计数；（4）菌株初筛：从各处理组分分别挑取20个单菌落进行斜面传代以及后续的摇瓶初筛；（5）菌株复筛：从初筛结果中选出效价高的突变菌株，经反复多次复筛，选出前10%的突变菌株再进行复筛，复筛时一株作三个平行，对挑选出的典型诱变菌株，逐一进行发酵摇瓶考察，选择起步效价、放瓶单位和菌浓均较高的菌种，即为含有生产维生素B12的突变菌株。