[发明专利]一种修复哺乳动物肠道损伤冻干粉的制备方法

摘要

本发明提供了一种修复哺乳动物肠道损伤冻干粉的制备方法，涉及生物干细胞技术领域，通过筛选培养对象并分离、脐带清洗及处理、脐带组织培养、间充质干细胞传代培养、间充质干细胞培养上清液处理以及冻干粉的制备等多重工艺手段，实现了制备出用于修复哺乳动物肠道损伤的含有高活性的脐带间充质干细胞分泌的多种细胞因子的试剂。

主权项

1.一种修复哺乳动物肠道损伤冻干粉的制备方法,其特征在于，包括以下步骤：(1)筛选培养对象并分离：脐带的筛选是选取孕妇年龄在22‑28周岁，孕期≤40周，健康足月的新生儿脐带靠近婴儿端约20cm左右，置于含双抗的脐带采集液保存，于冰盒内尽快运输；(2)脐带清洗及处理：置于无菌杯皿中用75％酒精快速清洗一遍，再用含双抗的无菌生理盐水反复冲洗，直至无明显血块；将脐带纵向剖开，剔除血管；用含双抗的无菌生理盐水将组织块漂洗干净，并用眼科剪将脐带分小段剪碎置于无菌杯皿中，再进一步将脐带剪碎至细小组织块；(3)脐带组织培养：将组织块按照合适的密度接种于培养瓶底部，添加适量的含血清代替物的DMEM/F12培养液，将瓶身翻转瓶底想上放置于37℃，5％的CO2的培养箱中贴壁4h，然后翻转瓶身瓶底向下静置于培养箱中培养，定期观察更换或添加培养液；8d左右在显微镜下观察，可见组织块周围有成纤维状细胞爬出，去除组织块更换培养液继续培养2d左右，此时细胞为P0，用TrypLE消化将贴壁细胞转移到新的培养瓶中培养，此时细胞为P1；(4)间充质干细胞传代培养：将步骤(3)中分离的细胞继续传代培养至P6，传代是当培养瓶中细胞生长达到80％融合时，TrypLE消化细胞，1∶4传代培养，开始收集P2至P6的培养上清；(5)间充质干细胞培养上清离心、纯化和过滤除菌：将(4)中收集的培养上清液进行高速离心，重新用无菌无热原容器收集离心后上清；将离心后上清液浓缩处理，再通过过滤装置对浓缩液进行除菌并分装至无菌无热原瓶中；(6)冻干粉的制备：冻干处理浓缩液，在浓缩液液中加入KFG以及冻干保护剂；经冷冻干干燥处理之后制成间充质干细胞因子冻干粉。