[发明专利]一种利用RNA位点特异性核酸酶的基因克隆方法在审
| 申请号： | 201811129780.4 | 申请日： | 2018-09-27 |
| 公开（公告）号： | CN109266725A | 公开（公告）日： | 2019-01-25 |
| 发明（设计）人： | 刘喜朋;林振华 | 申请（专利权）人： | 苏州泰康吉安仪器科技有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/686 | 分类号： | C12Q1/686;C12Q1/6806 |
| 代理公司： | 常州佰业腾飞专利代理事务所(普通合伙) 32231 | 代理人： | 李杰 |
| 地址： | 215000 江苏省苏州市相城经济*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种利用RNA位点特异性核酸酶的基因克隆方法，利用RNA嵌合引物，扩增载体与目标基因，然后将扩增片段用核酸酶HII与HIII进行消化，生成3’单链DNA，载体与目标基因的3’单链DNA彼此配对，形成带缺口重组质粒，转化大肠杆菌后缺口被修复完整，形成完好的环状重组质粒，进行基因克隆。通过上述方式，本发明不再依赖于限制性内切酶对载体和目标基因进行特异性切割，而且载体和目标基因之间的配对区长达10‑30个碱基，不再需要DNA连接酶对DNA进行连接缝合，可以直接转化大肠杆菌，极大地增加了一次基因克隆操作的目标基因数量，非常适合于高通量基因克隆，能应用于重组DNA的构建(基因克隆)、基因点突变等，也可用于精准医疗等领域的DNA文库构建。 | ||
| 搜索关键词： | 基因克隆 目标基因 核酸酶 大肠杆菌 位点特异性 单链DNA 构建 环状重组质粒 限制性内切酶 特异性切割 扩增片段 嵌合引物 直接转化 重组质粒 重组DNA 点突变 高通量 配对区 缝合 碱基 可用 扩增 配对 消化 修复 基因 医疗 应用 转化 | ||
【主权项】：
1.一种利用RNA位点特异性核酸酶的基因克隆方法，其特征在于，包括步骤为：(1)利用含有RNA碱基的引物PCR扩增目标基因和载体；(2)利用核酸酶HII或核酸酶HIII对步骤(1)得到的PCR扩增后的目标基因和载体进行消化处理，得到目标基因的单链DNA尾巴和载体的单链DNA尾巴；(3)将步骤(2)得到的目标基因的单链DNA尾巴和载体的单链DNA尾巴配对，形成带缺口的含有目标基因的重组载体；(4)步骤(3)得到的带缺口的含有目标基因的重组载体转化大肠杆菌后，所述含有目标基因的重组载体的缺口被修复好，得到含目标基因的完整重组载体。
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