[发明专利]一种分离自桑椹白化病果新病原的鉴定及致病性检测方法

摘要

本发明公开了一种分离自桑椹白化病果新病原的鉴定及致病性检测方法，包括以下步骤：步骤1、病原菌的分离；步骤2、致病性检测；步骤3、分离菌株的鉴定。本发明将传统的形态学观察与现代分子生物学技术相结合，对桑椹白化病的病原菌进行了鉴定，为丰富桑椹白化病的病原菌库，探寻桑椹白化病的发病原因和规律奠定理论基础，同时也为桑椹白化病的防治提供科学依据，以期在实践生产中减少桑椹白化病带来的损失。

主权项

1.一种分离自桑椹白化病果新病原的鉴定及致病性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、病原菌的分离在无菌操作环境下，将桑椹病果用无菌水冲洗干净，滤纸吸干水分后，置于75％的酒精中浸泡几秒钟，在酒精灯火焰上灼烧一下，之后使用无菌刀片划开病果，将其切成小块，用无菌镊子取病果中间的小块置于PDA培养基上，每个培养基上放置4‑5块,25℃恒温培养箱中暗培养；待菌落长出后根据菌落特征，采用顶端菌丝挑取法进行纯化，并将纯化的单一菌株移入PDA斜面培养基，4℃保藏备用；步骤2、致病性检测2.1实验室活体叶片接种将PDA平板上28℃培养7天的菌株打取直径6mm的菌饼，接种到3‑5叶期活体幼苗的叶片上，每棵幼苗接种3个菌饼，28℃恒温培养箱暗培养两天后，去除菌饼，置于光照培养箱中继续培养并观察记录叶片的发病情况；以接种PDA的活体幼苗为空白对照,每个处理重复3次；对接种发病的幼苗，取病健交界组织，用1％的次氯酸钠溶液浸泡5min，70％的乙醇处理20s，无菌水清洗数次后置于PDA平板上，28℃培养7天，观察再次分离的菌株与原接种菌株的差异；2.2田间桑椹接种在五月下旬桑果成熟之际，将待测菌株打取直径6mm的菌饼，接种在选定的正常桑椹上，并用保鲜膜轻轻缠绕固定，再进行套袋处理，减少其他因素的影响；每棵桑树接种3个菌饼，接种两天后去除菌饼，观察并记录桑椹的发病情况；以接种PDA的正常桑椹为空白对照,每个处理重复3次；对接种发病的桑椹，同上述实验室活体叶片接种的方法进行再分离；步骤3、分离菌株的鉴定3.1形态学鉴定将保存的菌株Z4转接于PDA培养基上复苏活化后，用打孔器打取直径6mm的菌饼接入新的PDA培养基上,28℃培养，每天观察并记录纯化菌株的菌落形态、颜色及生长情况，并使用光学显微镜观察其大、小分生孢子的显微形态特征，根据真菌分类系统初步进行种类鉴定；3.2分子生物学鉴定采用CTAB法提取菌株基因组DNA，以其为模板，分别用真菌EF‑1ɑ：EF‑1H：5'‑ATGGGTAAGGAAGACAAGAC‑3'，EF‑2T：5'‑GGAAGTACCAGTGATCATGTT‑3'和ITS：ITS1：5'‑TCCGTAGGTGAACCTGCGG‑3'，ITS4：5'‑TCCTCCGCTTATTGATATGC‑3'基因通用引物进行PCR扩增；扩增体系为25μl，其中模板DNA1μl，上下引物各1μl，ddH2O10μl，Taq Mix12μl；扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，34个循环；72℃延伸5min；扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序；获得的EF‑1ɑ序列和ITS序列分别在GenBank数据库中进行数据库比较，下载同源性较高的序列，利用MEGA5.0软件，使用NJ法进行1000次步长计算，构建系统发育树，确定菌株的分类地位。