[发明专利]以三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯整体柱为基质的固定化酶反应器

摘要

本发明涉及一种以三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯整体柱为基质的固定化酶反应器。以具有三个双键的三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（TRIM）、甲苯、异辛烷、偶氮二异丁腈来制备骨架材料作为胰蛋白酶的固定基质，TRIM骨架表面有剩余的双键存在，能够在常温下与胰蛋白酶表面的自由巯基发生点击反应而将酶键合在整体柱上。本发明制备的酶反应器无需在固定基质上引入功能基，制备更简便；也避免了胰蛋白酶功能化，防止了酶变性失活。本研究为人们研究酶反应器的固定基质提供了一种新思路，所制备的酶反应器可用于蛋白质的高效快速酶解。

主权项

1.一种以三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯整体柱为基质的固定化酶反应器，其特征在于该固定化酶反应器是按下述具体方法步骤制备：1）有机整体柱的制备：TRIM 200 μL，异辛烷680 μL和甲苯120 μL作为致孔剂，偶氮二异丁腈3.6 mg为引发剂，混合超声后形成预聚合液注入已处理好的毛细管中，用胶塞封住毛细管两端，置于50℃水浴锅内，反24h后取出毛细管，用乙腈冲洗除去未反应的溶液及引发剂；2）胰蛋白酶二硫键的还原：在pH 8.0的Tris‑HCl缓冲液中分别配制浓度为10 mg/mL胰蛋白酶溶液和浓度为1 mg/mL三(2‑羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)溶液；然后按TCEP：胰蛋白酶溶液比例为1:10（v/v）混合两种溶液，混合溶液反应3 h，使胰蛋白酶中双硫键还原断裂；然后混合液在4ºC以10000 rpm转速离心10 min除去不溶物；待得到的溶液温度恢复到室温后，加入过硫酸铵使其浓度为1 mg/mL；向上述溶液中加入N,N'‑亚甲基双丙烯酰胺（BAA）使其浓度为2 mg/mL，震荡使其充分溶解，制备好的溶液即为酶衍生液；3）胰蛋白酶的固定：在酶固定化之前，先将TRIM有机整体柱用氮气吹干，然后将上述酶衍生液注入到整体柱中，长度为10 cm；注入酶衍生液的整体柱在25℃反应5 h以充分固定；待反应完成后，酶柱用20 mM的pH 8.0的Tris‑HCl缓冲液冲洗1 h除去未反应的物质；酶柱保存于4℃冰箱备用。