[发明专利]一种利用蛋白IHF-α构建和表达耐热性抗菌肽融合蛋白的方法

摘要

本发明公开一种利用蛋白IHF‑α构建和表达耐热性抗菌肽融合蛋白的方法，通过IHF‑α蛋白与耐热性抗菌肽进行融合基因设计，设计成为含有IHF‑α蛋白与耐热性抗菌肽基因序列的质粒，在大肠杆菌中进行转化和克隆表达得到蛋白后，并对蛋白纯化，最终得到含有耐热性抗菌肽的融合蛋白。本发明方法将难表达的耐热性抗菌肽利用耐热性的IHF‑α融合表达，使抗菌肽潜在的抑菌性能够得到抑制，使得抗菌肽可以可溶性表达。该方法操作简单，将难表达、小分子量的抗菌肽，通过与耐热性的IHF‑α联合表达，使得耐热性抗菌肽快速简便获得。

主权项

1.一种利用蛋白IHF‑α构建和表达耐热性抗菌肽融合蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：一、表达载体构建：选取耐热性抗菌肽与IHF‑α设计融合蛋白，合成后卡入到pET‑22b质粒表达载体中，融合蛋白的合成与表达采用常规方法；二、转化克隆、蛋白表达纯化步骤：1)转化对融合蛋白质粒表达载体进行热激法转化：将BL21感受态细胞置于冰上，加入重组质粒，冰上静置30min，置于金属浴42℃中热激75s，冰上静置5min，加入LB液体培养基，225rpm，37℃培养1h，取菌液涂布于LB固体培养基平板，将平板倒置于37℃培养箱内过夜培养；2)蛋白诱导2).1在LB液体培养基中加千分之一体积数的100μg/mL氨苄西林Amp，挑取单菌落，混匀置于37℃，225rpm摇床中培养过夜12小时；2).2扩培，在LB液体培养基中加入千分之一体积数的100μg/mL氨苄西林Amp，再加入百分之一体积数的过夜培养的菌液，置于37℃、225rpm摇床中培养，培养至进入对数生长期测定OD600值为0.6‑0.8后，加入诱导剂IPTG诱导，诱导条件为低温16℃、225rpm诱导13小时；3)提取蛋白3).1将诱导过的菌液，离心13000rpm，1min，4℃，收集沉淀部分为离心菌体；3).2离心菌体加入Buffer A缓冲溶液充分吹打混匀；3).3离心13000rpm，10min，4℃，保留沉淀；3).4在沉淀中加入Buffer A缓冲溶液，重悬沉淀，使沉淀充分溶解在溶液中；3).5利用超声破碎机在超声强度为20％的条件下，每次间隔5s持续超声破碎5s，直至溶液呈半透明状态；3).6离心13000rpm，4℃，30min后，弃去沉淀保留上清溶液；4)蛋白纯化4).1将上一步获得的上清溶液，加入30％‑80％的饱和硫酸铵溶液，充分混匀，随后置于4℃冰箱静置2‑6h；4).4将溶液在85℃金属浴中加热，20min；4).5离心13000rpm，4℃，30min，除去不可溶解以及不耐热的蛋白杂质，弃去沉淀，保留上清溶液。