[发明专利]一种农杆菌质粒DNA的提取方法

摘要

本发明公开了一种农杆菌质粒DNA的提取方法，包括如下步骤：（1）农杆菌菌液培养；（2）菌体收集；（3）农杆菌细胞破裂；（4）质粒DNA的提取。本发明提供了一种农杆菌质粒DNA的提取方法，方法科学合理，缩短了提取的时间，提高了提取的效率，提高了质粒DNA的纯度和含量，并且安全性高，具有很好的市场推广应用价值。

主权项

1.一种农杆菌质粒DNA的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）农杆菌菌液培养：挑取转化后的农杆菌单菌落投入到4~5mL带有卡那霉素的YEB液体培养基中，然后将YEB培养基置于摇床中进行震荡培养，在振荡培养的同时进行超声波处理；（2）菌体收集：等到步骤（1）中菌液的OD值达到1.2~1.3时，将菌液置于离心机中进行分步离心处理，首先是以6000~7000rpm的转速离心1~2min，弃上清，然后以3000~4000rpm的转速离心1~2min，弃上清得菌体；（3）农杆菌细胞破裂：量取320~350mL预混液置于步骤（2）装有菌体的离心管中，然后加入0.9~1mL溶菌酶，再用无菌的均质机进行均质处理30~40s后，上下颠倒离心管直至菌体完全溶解，最后置于‑2~0℃环境中进行放置4~6min；（4）质粒DNA的提取：a. 将步骤（3）中破裂后的细胞溶液置于离心机中进行离心处理，离心机的转速为11000~13000rpm，离心处理7~8min后，取上清置于新的无菌离心管中，然后向新的无菌离心管中加入与上清等体积预冷的无水乙醇，混匀后置于‑50~‑40℃的环境中放置3~5min；b. 将操作a中的混合液置于离心机中进行离心处理，离心机的转速为11000~13000rpm，离心4~5min后，弃上清；c. 量取60~80mL TE Buffer溶液置于操作b的离心管中，轻弹离心管的底部，直至沉淀完全溶解即可。