[发明专利]低共熔溶剂整体柱酶反应器及其制备方法

摘要

本发明涉及一种低共熔溶剂整体柱酶反应器及其制备方法。制备步骤：将自由基引发剂偶氮二异丁腈加入低共熔溶剂/离子液体中，超声分散后，加入功能单体甲基丙烯酸、共聚单体甲基丙烯酸丁酯、交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯，超声溶解后注入毛细管中，热引发合成整体柱，用三(2‑羰基乙基)磷盐酸盐（TCEP‑HCl）试剂使胰蛋白酶中的双硫键还原为巯基，加入过硫酸铵和N,N’‑亚甲基双丙烯酰胺制备酶衍生液，在室温下与整体柱反应固定到整体柱表面，进行酶解蛋白。整体柱结构稳定，对酶活性影响较低，可作为重复利用的新型酶反应器酶解蛋白溶液。本发明采用原位聚合法在毛细管内直接聚合，合成方法简便易行，操作简单，聚合时间较短，成本低廉，具有广泛的应用前景。

主权项

1.一种低共熔溶剂整体柱酶反应器，其特征在于：它是按下述方法步骤制备：1）将氯化胆碱加入乙二醇中，油浴加热4小时后完全溶解，即得到氯化胆碱‑乙二醇低共熔溶剂；其中，氯化胆碱与乙二醇的质量比为1:3；2）将自由基引发剂偶氮二异丁腈（AIBN）溶于步骤1）的低共熔溶剂与离子液体中超声混匀后，加入甲基丙烯酸（MAA）、甲基丙烯酸甲酯（BMA）、二甲基丙烯酸乙二醇酯（EDMA）得到预聚合液，超声，通氮气除去溶液中溶解的氧；注入经γ‑甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷(γ‑MPS)预处理的石英毛细管柱，65℃热聚合反应1.5小时，反应完全后通乙腈冲毛细管柱，去除未反应的试剂；3）还原胰蛋白酶中的双硫键：用pH 8.0的三（羟甲基）氨基甲烷（Tris‑HCl）缓冲液配制10 mg/mL的胰蛋白酶溶液和1 mg/mL的三（2‑羰基乙基）磷盐酸盐溶液，按胰蛋白酶溶液与三（2‑羰基乙基）磷盐酸盐溶液体积比为1:10混合溶液，25℃反应3小时后，4℃下离心10分钟，转速10000 rpm，除去不溶物；溶液恢复到室温后取上清液5 mL加入过硫酸铵5 mg和N,N’‑亚甲基双丙烯酰胺10 mg，震荡使其充分溶解即得酶衍生液；4）用1 mL注射器将酶衍生液注入步骤2）中的整体柱，在室温下反应5小时将酶固定到整体柱表面，反应结束后用pH 8.0的Tris‑HCl 缓冲液冲洗1小时，以洗去未反应的物质，置于4℃冰箱保存。