[发明专利]长春花细胞高产长春碱的培养方法

摘要

本发明提供一种长春花细胞高产长春碱的培养方法，其包括以下步骤：1)培育长春花愈伤组织；2)培育稳定遗传的长春花细胞系；3)将步骤2)获得的长春花细胞系接种到液体悬浮培养基中进行诱导培养，以刺激长春花中生物碱的积累，所述诱导条件为：长春花细胞系在液体悬浮培养基培养第10‑15天开始，将培养温度从32‑35℃降低至25～28℃，通入一氧化碳气体以及往液体悬浮培养基中添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银，维持该温度继续培养2‑3天后，恢复培养温度到32‑35℃，培养4‑5天，交替的进行升温和降温培养，直至该培养结束，获得高产长春碱的长春花细胞。本发明具有细胞生长速度快、长春碱累积含量高等特点。

主权项

1.一种长春花细胞高产长春碱的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：1)挑选饱满的长春花种子，使用弱酸电解水浸泡10‑20秒，使用无菌去离子水洗净，使用在含有10‑20mg/L维生素C、7‑9g/L琼脂和0.1‑0.3g/L寡糖素的B5基础培养基上培养得到无菌苗，以所述无菌苗的胚轴为外植体，接入愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养，培养温度为32‑35℃，每天交替进行光照和黑暗培养，诱导出愈伤组织，然后将愈伤组织转入继代培养基中，每20‑25天继代一次，继代培养3‑5次，以获得稳定的长春花愈伤组织；2)选取生长旺盛、质地松散、状态稳定均一的所述长春花愈伤组织，接种到液体悬浮培养基中，然后往液体悬浮培养基中添加玻璃珠，在震荡摇床中进行高速振荡8‑10min，摇床转速180～200rpm，然后置于光照摇床中进行培养，摇床转速为100‑120rpm，光照强度1500～2000lx，光照时间10～15h/day，每20‑22天继代培养1次，继代培养5～8次，获得稳定遗传的长春花细胞系；3)将步骤2)获得的长春花细胞系接种到液体悬浮培养基中进行诱导培养，以刺激长春花中生物碱的积累，所述诱导条件为：长春花细胞系在液体悬浮培养基培养第10‑15天开始，将培养温度从32‑35℃降低至25～28℃，通入一氧化碳气体以及往液体悬浮培养基中添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银，维持该温度继续培养2‑3天后，恢复培养温度到32‑35℃，培养4‑5天，交替的进行升温和降温培养，直至该培养结束，获得高产长春碱的长春花细胞。