[发明专利]一种凝血酶的检测方法

摘要

本发明涉及一种凝血酶检测方法。其基于邻位连接技术，即“proximity ligation assay”，简称PLA，诱导核酸分子发夹转换成DNA酶，即DNAzyme结构，进行熵驱动放大检测。在存在凝血酶的情况下，PLA可以诱导发夹的解锁，然后形成活性DNA酶。随后，DNA酶可以剪切底物链S‑DNA并诱导熵驱动的放大反应，通过将猝灭剂分子与羧基荧光素FAM分离，显著恢复荧光强度。荧光强度和凝血酶浓度之间存在良好的线性关系，范围为5pM至1nM，检测限度计算为1pM，提供了高可靠性和灵敏度。

主权项

1.一种凝血酶检测方法，包括如下步骤：(1)核酸分子发夹结构溶液的制备，将适体1制备形成核酸分子发夹结构，其中，适体1序列为5’‑GGTTGGTGTGGTTGGCCCCCCTGTGACAGCGAAGCAGGCCGAGCCTAGTTTTTTTTTCTGrATCGCATTTCTCAAAAAC‑3’；(2)邻位连接技术诱导核酸分子发夹转换为DNA酶结构，将适量待测凝血酶溶液加入到适量步骤(1)所得溶液和适量适体2的混合溶液中，进行PLA诱导发夹转换为DNA酶结构反应，其中，适体2序列为5’‑GAGAAATGGTCTGTCACACCCCCCAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT‑3’；(3)DNA酶结构的剪切，将步骤(2)所得溶液与10mM MgCl 2一起温育30分钟，进行剪切反应；(4)熵驱动的放大反应，将适量步骤(3)反应所得溶液加入到50nM DNA复合物与50nM燃料链序列F溶液中，孵育60分钟，进行熵驱动的放大反应，其中，DNA复合物由序列R，序列S和序列Q杂交后得到，序列R:5’‑TTTTTTTTTTTTTTTTCCCTTCGCATTTCTC‑3’，序列S:5’‑FAM‑CCTACGTCTCCAACTAACTTACGG‑3’，FAM代表羧基荧光素。序列Q:5’‑GTTTTTGAGAAATGCGAAGGGCCGTAAGTTAGTTGGAGACGTAGG‑Dabcyl‑3’，Dabcyl代表猝灭剂4‑(4‑二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸。燃料链序列F:5’‑CCTACGTCTCCAACTAACTTACGGCCCTTCGCATTTCTC‑3’；(5)荧光光谱检测，用荧光光谱仪获取步骤(4)所得溶液的荧光光谱；(6)计算凝血酶浓度，用标准曲线法，通过荧光强度计算凝血酶浓度。