[发明专利]一种胎盘造血干细胞制备方法

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种胎盘造血干细胞制备方法，包括以下步骤：(1)胎盘预处理；(2)胎盘一次灌洗；(3)胎盘二次灌洗；(4)胎盘三次灌洗；(5)混合离心；(6)胎盘初步纯化；(7)造血干细胞的冻存；该制备方法可提高CD34阳性细胞的分离数量、细胞活力，而且所采用的试剂均无潜在风险，可应用于临床，并降低了实验成本。

主权项

1.一种胎盘造血干细胞制备方法，其特征在于所述制备方法包括以下步骤：(1)胎盘预处理：在无菌条件下，将新鲜采集的足月完整健康胎盘用胎盘清洗液清洗，备用；(2)胎盘一次灌洗：取步骤(1)中的胎盘，将胎盘灌洗液A沿胎盘脐动脉注入胎盘内部，由脐静脉收集灌洗后的液体组分；(3)胎盘二次灌洗：取步骤(2)中的胎盘，将灌洗液B沿胎盘脐动脉注入胎盘内部，注入过程中按压胎盘使灌洗液浸润胎盘内部血管，静置15‑30min，由脐静脉收集灌洗后的液体组分；(4)胎盘三次灌洗：取步骤(3)中的胎盘，另取新的胎盘灌洗液A沿脐动脉注入由脐静脉输出，经过2‑5次反复冲洗，收集灌洗后的液体组分；(5)混合离心：合并步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)所收集的液体组分，离心，去除上清，向收集的细胞沉淀中加入勃脉力A，得到细胞悬液；(6)初步纯化：取步骤(5)中的细胞悬液，将细胞悬液与淋巴细胞分离液混合，离心，收集的白膜层即为包含了造血干细胞的单个核细胞；(7)造血干细胞的冻存：取步骤(6)中的单个核细胞，加入勃脉力A离心洗两遍，用4℃预冷的冻存液将得到的单个核细胞按1×106个/mL细胞量重悬，得到的细胞重悬液分装后置于冰上，置于程序降温冻存盒中于‑80℃冻存，24h内转移至液氮罐中冻存。