[发明专利]一种获得铁皮石斛幼苗阶段菌根真菌的方法

摘要

本发明涉及一种获得对兰科植物幼苗阶段菌根真菌的方法，具体来说涉及一种获得铁皮石斛(Dendrobium officinale)幼苗阶段菌根真菌的方法，通过铁皮石斛种子在MS培养基上进行非共生萌发，得到铁皮石斛无菌幼苗，移栽到有野生铁皮石斛生长的原生境，一定时间后通过镜检发现有真菌侵入幼苗根中，当形成菌丝团后，采集幼苗的根从中分离得到菌根真菌菌，进行纯化培养，先进行形态鉴定分组，再进行分子鉴定并保存。这种行新的方法，为获得促进幼苗阶段菌根真菌奠定了一定基础。本发明利用铁皮石斛幼苗阶段和菌根真菌的关系为培育种苗开辟了一条新的途径。

主权项

1.一种获得铁皮石斛幼苗阶段菌根真菌的方法，其特征包括以下的步骤：（1）采铁皮石斛成熟但果荚尚未裂的果实，将种子干燥后用2%次氯酸钠溶液消毒3分钟，无菌水漂洗3次后播种在制作好的MS培养基上，在光照强度为2000Lx‑3000Lx,温度25℃±2℃，光周期12h/12h L/D的条件进行非共生萌发，得到无菌苗；（2）选择铁皮石斛的原生境，目的是保证该环境中存在和铁皮石斛幼苗形成菌根的真菌；将获得的无菌苗移栽到该原生境树木的树干上或者是岩石上，这样做的原因是铁皮石斛是附生植物，多生长在树木的枝干和岩石上；并用尼龙绳固定，用该地苔藓覆盖铁皮石斛幼苗的根，以起到保湿的作用；（3）定植成活后，每个月定期从采取铁皮石斛苗的根，进行显微镜观察，当发现根中有菌丝缠绕成团时，也就是形成菌丝团了，就可以进行菌丝团的分离；（4）菌丝团的分离是将采回来的根依次用自来水冲洗，次氯酸钠溶液消毒，无菌水漂洗3次，用解剖针刮取菌丝团，用移液枪将菌丝团接种在马铃薯葡萄糖培养基（PDA）上进行培养；（5）当接种的菌丝团生长出新的菌丝时，用无菌接种针不断地挑取真菌菌落边缘处的菌丝到新的PDA培养基上，转移3‑5次后，得到纯菌落；（6）首先进行形态分类并分组，进行分子鉴定与保藏，所获得的铁皮石斛幼苗阶段菌根真菌进行分子鉴定和Blast比对；分子鉴定中，采用CTAB法提取真菌DNA，PCR扩增所用引物为ITS1和ITS4；PCR扩增产物为上海生工生物工程有限公司进行测序。