[发明专利]一种烟草叶片接种携目的基因农杆菌的方法及接种装置

摘要

本发明是一种烟草叶片接种携目的基因农杆菌的方法及接种装置。本方法通过：接种装置消毒；YEB培养基配制；渗透液配制；培养单菌落；扩大培养；制备菌体悬浮液；烟草叶片接种；培养接种烟叶植株等8个步骤完成，本发明针对为大批量烟草叶片接种携目的基因的农杆菌，利用新型植物叶片接种菌液装置，快速便捷地为大批量、规模化的烟叶接种农杆菌。与传统常用方法相比，不仅提高了工作效率、保证了接种效果，还节省了人力与材料。

主权项

1.一种烟草叶片接种携目的基因农杆菌的方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤1，接种装置消毒；步骤2，YEB培养基配制，5g/L牛肉膏粉末，5g/L蛋白胨，5g/L蔗糖，1g/L酵母提取物，0.5g/L MgSO4•7H2O，15g/L琼脂粉（液体培养基不添加），加ddH2O溶解，高温高压灭菌：121℃高温高压15min，待培养基冷却至60℃左右再加所需抗生素，之后将在每个100 mm培养皿中倒入30 mL培养基，冷却凝固备用；步骤3，渗透液配制，MES 10 mmol/L , MgCl210 mmol/L，乙酰丁香酮（AS）200 μmol/L，现配现用；母液配制如下：MES（1 mol/L），用dd 水配制，调pH值（加NaOH）至5.6，过滤除菌；MgCl2（1 mol/L），用dd H2O配制，过滤除菌；乙酰丁香酮（100 mmol/L），称取0.3924 g乙酰丁香酮（As）溶于二甲基亚砜（DMSO），用DMSO定容至20 ml，布氏滤器（装有机滤膜）过滤除菌, ‑20 ℃保存；步骤4，培养单菌落，将携带目的基因的农杆菌在步骤2中配制的YEB平板培养基上划线，于28 ℃黑暗培养16‑30 h，直至长出单菌落；步骤5，扩大培养，挑取步骤4中YEB培养基上长出的单菌落，将其放于步骤1中配制的YEB液体培养基中，于28 ℃，200 rpm，黑暗振荡培养16‑24 h，直至其OD值为0.6‑0.8，最大OD值不能超过1.0；步骤6，制备菌体悬浮液，将菌液置于50mL无菌离心管中，离心（4000 rpm，15 min，4 ℃）去上清，收集菌体，用步骤3中配制的渗透液重悬菌体，使菌液的OD值达到1.5‑1.8；步骤7，烟草叶片接种，将步骤6中制备好的菌体悬浮液装入步骤1中已消毒的储液管中，把烟草叶片置于装置底座上，按压手柄使接种头上的滚珠针头挤压烟草叶片造成伤口，针头中滚珠挤压上抬，菌液从针管中流出到叶盘伤口处，抬起手柄即完成一次接种，根据叶片大小更换位置接种；步骤8，培养接种烟叶植株，将烟草植株放在25 ℃，65 %‑75 %湿度，黑暗24h后，再放入以下环境中培养：光照14 h，25 ℃，65 %‑75 %湿度，黑暗10 h，25 ℃，65 %‑75 %湿度，45天烟草植株可开花。