[发明专利]一种检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞DNA损伤的方法

摘要

本发明公开一种检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞DNA损伤的方法，包括以下步骤：(1)样品前处理；(2)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的制备；(3)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的细胞浓度计算；(4)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的接种；(5)受试物暴露；(6)收集细胞；(7)细胞固定；(8)染色；(9)流式检测和分析。本发明样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞周期的影响。

主权项

1.一种检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞DNA损伤的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)样品前处理：采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0mL，持续时间3s，抽吸频率为30s的抽吸条件下，连续抽吸10口，用直径为44mm的剑桥滤片捕集，分别于抽吸前、抽吸后称量烟气捕集器的质量，按照公式(1)计算加热不燃烧卷烟总粒相物的质量mTPM；mTPM＝m1‑m0     (1)式中：m0——抽吸前烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；m1——抽吸后烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；捕集完毕后，将捕集后的剑桥滤片放入50mL的三角瓶中，加入二甲基亚砜，使加热不燃烧卷烟总粒相物在二甲基亚砜中的浓度为40mg/mL；将此三角瓶置于超声仪上超声30min；再用无菌滤纸过滤收集二甲基亚砜萃取液，分装至1mL的冻存管中，‑80℃保存待用；(2)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的制备：人鼻腔上皮细胞RPMI2650复苏后，接种到25cm2细胞培养瓶中，加入10mLRPMI1640细胞培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至70％～90％的汇合率时，移除培养瓶中的RPMI1640细胞培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1mL 0.25％(w/v)的胰蛋白酶溶液单层孵育1～2min，用RPMI1640细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；(3)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤(2)所得人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，得到每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；(4)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的接种：将步骤(3)计数后的人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液用RPMI1640细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，再按接种量为2mL/孔接种到6孔细胞培养板中，然后将6孔细胞培养板置于37℃、5％CO2培养箱内培养24h；(5)受试物暴露：把步骤(1)中制备的样品用PBS稀释成400μg/mL的工作液备用，取出6孔细胞培养板，去除细胞培养液，将不同剂量的待测液加入细胞培养板中，每个剂量设3个复孔，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h；(6)收集细胞：取出步骤(5)中的细胞培养板，将同一培养孔中的细胞培养液和消化后的细胞收集到同一个15mL离心管中，不同培养孔分开收集，1000r/min转速下离心5分钟，弃上清液；(7)细胞固定：在步骤(6)每支离心管中加入1mL4℃预冷的70％的乙醇，轻轻吹打均匀，4℃固定2h；1000r/min转速下离心5分钟，弃上清液，加入500μL4℃预冷的PBS缓冲液，重悬细胞，1000r/min转速下再次离心5分钟，弃上清液，获得细胞；(8)封闭：取步骤(7)获得的细胞加入分别含0.2％TritonX‑100和10％FBS的PBS200μL，1000r/min转速下离心5分钟，弃上清，获得细胞；(9)细胞破膜：取步骤(8)获得的细胞，分别加入体积百分比0.2％的TritonX‑100和质量体积比0.1％的BSA的PBS溶液1mL重悬细胞，处理固定细胞20min以使细胞膜通透；1000r/min转速下离心5分钟，弃上清；加入5ml PBS重悬细胞，1000r/min转速下再次离心5分钟，获得细胞；(10)细胞染色：加入FITC标记的γH2AX抗体工作液100μL，避光孵育3h；1000r/min转速下离心5分钟，弃上清液；加入300μLPBS重悬细胞；(11)流式检测和分析：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测，进行荧光强度分析。