[发明专利]唾液酸化糖链同分异构体的高分辨顺序分离和准确定量分析方法

摘要

本发明提出了一种唾液酸化糖链同分异构体的高分辨顺序分离和准确定量分析方法，包括：利用PNGase F酶对糖蛋白上的N‑糖链进行释放；糖链的唾液酸通过酰胺化方法标记同位素试剂(d0/d5‑)苯胺，以对唾液酸进行保护和稳定同位素标记；利用固相萃取技术(C18柱)除去中性糖链，以避免中性糖链的干扰；唾液酸化糖链的还原末端再标记上吉拉德试剂P(GP)以屏蔽活性醛基和提高质谱检测灵敏度；唾液酸的特异性衍生技术对连接异构体进行识别；最后使用RP‑HPLC‑MS技术对上述处理过的唾液酸化糖链衍生物的同分异构体进行区分、鉴定和定量分析。该方法通用性强，首次实现了在同分异构体水平对唾液酸化糖链的准确定量分析。

主权项

1.唾液酸化糖链同分异构体的高分辨顺序分离和准确定量分析方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：分别称取5mg糖蛋白样品1和2各三份，利用PNGase F酶分别进行N‑糖链的释放；释放的N‑糖链样品依次经过C18固相萃取柱和石墨碳固相萃取柱纯化，得到纯化的N‑糖链样品1和2各三份；S2：S1中纯化的N‑糖链样品1和2各取两份；(a)第一份利用d0‑苯胺通过酰胺化方法对糖链的唾液酸进行标记，然后利用固相萃取技术除去中性糖链，唾液酸化糖链还原末端标记吉拉德试剂P(GP)以屏蔽活性醛基和提高后续质谱检测灵敏度，得到d0‑苯胺和GP标记的唾液酸化N‑糖链衍生物，记为d0‑苯胺衍生物；(b)第二份利用d5‑苯胺进行唾液酸连接异构体的特异性衍生，并进行GP标记，得到特异性糖链衍生物，记为d5‑苯胺衍生物；S3：将S2中获得的N‑糖链样品1的d0‑苯胺衍生物和d5‑苯胺衍生物进行混合，N‑糖链样品2的d0‑苯胺衍生物和d5‑苯胺衍生物进行混合，利用反相高效液相色谱和质谱联用技术(RP‑HPLC‑MS)对N‑糖链样品1和2的唾液酸化糖链连接异构体分别进行鉴定；S4：S1中纯化的N‑糖链样品1和2各取余下的那一份，参考S2中(a)步骤，对N‑糖链样品1和2通过酰胺化反应分别标记d0‑苯胺和d5‑苯胺，混合两种样品，然后标记GP，用反相高效液相色谱和质谱联用技术(RP‑HPLC‑MS)进行检测，对每个糖链提取离子流图(EIC)，并根据同位素目标峰的峰面积比值进行样品间的定量比较分析。