[发明专利]CMPF均相酶免疫检测试剂盒、制备方法及检测方法

摘要

本发明公开了一种CMPF均相酶免疫检测试剂盒、制备方法及检测方法，试剂盒的CMPF抗体的免疫原由CMPF与蛋白质或多聚赖氨酸偶联物作为免疫原进行免疫获得。分别利用CMPF支链末端的‑COOH与蛋白质或多聚赖氨酸分子上的‑NH2进行偶联；接着利用这些偶联物免疫物作为免疫原进行免疫小鼠或家兔，最后获得特异性的抗CMPF的单克隆或多克隆抗体；并基于该抗CMPF的单克隆或多克隆抗体建立CMPF含量检测方法；该检测方法可在生化分析仪等大型自动化仪器上进行大样本自动化检测分析。检测方法具有检测灵敏度高，特异性强，检测重复性高和稳定性好等优点，本发明方法检测灵敏度0.5μg/L。

主权项

1.一种CMPF均相酶免疫检测试剂盒，其特征在于，包括试剂R1、试剂R2和标准品溶液，/n所述试剂R1由如下组分和含量组成：/n磷酸盐缓冲液 50-200mM，/nCMPF抗体 5-500mg/L，/nNAD辅酶 1-10mM，/nG-6-P-Na2 3-20mM，/n表面活性剂 0.01-10g/L，/n稳定剂 0.1-0.5g/L；/n所述试剂R2由如下组分和含量组成：/n磷酸盐缓冲液 50-200mM，/nG6PDH-CMPF偶联物 5-500U/L，/nBSA 0.01-10g/L，/n表面活性剂 0.01-10g/L；/n所述标准品溶液，其由CMPF与校准品稀释液梯度稀释而成，所述标准品稀释液由如下组分和含量组成：/n磷酸盐缓冲液 0.05-0.2M，/nBSA 0.01-10g/L，/n稳定剂 0.1-0.5g/L；/n其中G6PDH-CMPF偶联物的制备，包括如下步骤：/n称取100 mgCMPF，用10ml二甲亚枫溶解，10KU葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，溶解于200mlpH7.3，100mM的磷酸盐缓冲液中，室温搅拌15分钟，再加入25 mg水溶性碳二亚胺粉末，室温避光温和搅拌180分钟，装入透析袋，自由通透分子大小<14KD，置4℃透析，每6小时换液1次，连续6-8次；/n用超滤膜包对透析液进行浓缩，浓缩体积至30ml，上G200凝胶层析柱3.0×50cm分离产物，收集G6PDH-CMPF峰，共收集80ml，对纯化水透析3次，冷冻干燥，得到4.7KU的G6PDH-CMPF；/n其中抗CMPF的特异性鼠源性单克隆IgG型抗体的制备，包括如下步骤：/nS1.CMPF-蛋白质偶联物或CMPF-多聚赖氨酸偶联物的制备/n将CMPF与载体蛋白质混合，并加入碳二亚胺，在碳二亚胺作用下，CMPF与载体蛋白质进行偶联反应，然后透析得到CMPF-蛋白质偶联物；或者载体蛋白质用多聚赖氨酸代替，得到CMPF-多聚赖氨酸偶联物；/nS2.动物免疫/n以CMPF-蛋白质偶联物或CMPF-多聚赖氨酸偶联物/次/只小鼠的浓度与等量的完全福氏佐剂混匀，皮下多点注射免疫Balb/c雌性小鼠，第1次与第2次间隔10-14天，以后每次间隔7天，连续5次，第2-5次CMPF-蛋白质偶联物或CMPF-多聚赖氨酸偶联物与等量的不完全福氏佐剂乳化混匀，间隔1周后采用尾静脉/腹腔注射无菌的CMPF-蛋白质偶联物或CMPF-多聚赖氨酸偶联物，以加强免疫1次，3天后细胞融合；/nS3.杂交瘤细胞的制备/n取步骤S2免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按体积比1:6在50%PEG的作用下融合，融合细胞先在次黄嘌呤-氨甲喋呤-胸腺嘧啶选择培养基中，在37℃、5% CO