[发明专利]人角膜缘微环境细胞的分离和培养方法及其组合鉴定方法在审
| 申请号： | 201811581933.9 | 申请日： | 2018-12-24 |
| 公开（公告）号： | CN109762786A | 公开（公告）日： | 2019-05-17 |
| 发明（设计）人： | 李贵刚;王玮;徐玲娟;李阳;王云明 | 申请（专利权）人： | 华中科技大学同济医学院附属同济医院 |
| 主分类号： | C12N5/079 | 分类号： | C12N5/079;C12Q1/02;C12Q1/6876;G01N33/68 |
| 代理公司： | 武汉开元知识产权代理有限公司 42104 | 代理人： | 胡镇西;冯超 |
| 地址： | 430030 湖*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种人角膜缘微环境细胞的分离和培养方法及其组合鉴定方法，该方法先获得角膜缘小片；用胶原酶A消化，然后用胰蛋白酶溶液进行消化，然后再接种于包被有Matrigel基质胶的六孔板上，获得原代的LNC；将原代的LNC置于改良的MESCM胚胎干细胞培养液连续培养传代扩增；采用Matrigel包被塑料培养板表面，MESCM无血清培养基扩增即得到人角膜缘微环境细胞。鉴定方法包含细胞形态学检测、细胞表面标志物检测、细胞多向诱导分化潜能检测和体外支持角膜缘干细胞活性检测共4种方法。本发明分离培养的人LNC细胞，具有明确的形态、抗原、功能特征，可以用于实验研究或者临床移植材料。 | ||
| 搜索关键词： | 细胞 人角膜 微环境 组合鉴定 包被 扩增 细胞表面标志物检测 胚胎干细胞培养液 传代 角膜缘干细胞 无血清培养基 胰蛋白酶溶液 培养板表面 细胞形态学 消化 分离培养 功能特征 活性检测 连续培养 潜能检测 实验研究 体外支持 移植材料 诱导分化 胶原酶 角膜缘 六孔板 抗原 多向 接种 改良 塑料 检测 | ||
【主权项】：
1.一种人角膜缘微环境细胞的分离和培养方法，其特征在于：包括以下步骤：1)选取完整保留角膜及角膜缘组织的标本，放射状切成等份的角膜缘小片；2)上述角膜缘小片用胶原酶A消化，然后用胰蛋白酶溶液进行消化，然后再接种于包被有Matrigel基质胶的六孔板上，获得原代的LNC；3)将原代的LNC置于改良的MESCM(modified embryonic SC medium)胚胎干细胞培养液连续培养传代扩增；当LNC的融合度到达80％时，用胰蛋白酶溶液进行消化；4)采用Matrigel包被塑料培养板表面，MESCM无血清培养基扩增LNC，完成细胞倍增，收获1×1010细胞，即得到人角膜缘微环境细胞。
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