[发明专利]一种利用毛细管电泳荧光SSR指纹图谱鉴别白蜡新品种金箭的方法

摘要

本发明公开了一种利用毛细管电泳荧光SSR指纹图谱鉴别白蜡新品种‘金箭’的方法，是由白蜡幼嫩叶片提取白蜡基因组DNA，并以提取的DNA为模板，利用筛选出的SSR引物对进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行毛细管电泳，根据电泳结果中每对SSR引物的峰值，组合形成白蜡新品种‘金箭’的SSR指纹图谱，实现对白蜡新品种‘金箭’的鉴别。本发明方法中利用筛出特异性稳定、多态性好的6对SSR特异引物，构建了白蜡新品种‘金箭’的指纹图谱，能够简便、快速、准确地完成白蜡新品种‘金箭’样品的鉴定。

主权项

1.一种利用毛细管电泳荧光SSR指纹图谱鉴别白蜡新品种‘金箭’的方法，步骤是：(1)由白蜡幼嫩叶片提取白蜡基因组DNA；(2)以提取的DNA为模板，利用筛选出的SSR引物对进行PCR扩增；(3)将PCR扩增产物进行毛细管电泳；(4)根据电泳结果中每对SSR引物的峰值，组合形成白蜡新品种‘金箭’的SSR指纹图谱，实现对白蜡新品种‘金箭’的鉴别；其特征是：步骤(1)中DNA的提取采用CTAB法，提取缓冲液中加入2％β‑巯基乙醇和2％PVP；紫外分光光度法测定DNA的浓度和纯度，稀释至30ng·μl^‑1，‑20℃保存，备用；步骤(2)筛选出的SSR引物对为6对，分别是F186和R186，F187和R187，F202和R202，F203和R203，F208和R208，F213和213其中在每对引物5′端加有选自FAM、TAMRA、HEX和ROX中的任意一种荧光标记，正向引物为与携带荧光标记的TP‑M13引物组成；所述F186和R186引物对中F186的核苷酸序列是如SEQ ID No.1所示的正向引物序列，R186的核苷酸序列是如SEQ ID No.2所示的正向引物序列，所述F187和R187引物对中F187的核苷酸序列是如SEQ ID No.3所示的正向引物序列，R187的核苷酸序列是如SEQ ID No.4所示的正向引物序列，所述F202和R202引物对中F202的核苷酸序列是如SEQ ID No.5所示的正向引物序列，R202的核苷酸序列是如SEQ ID No.6所示的正向引物序列，所述F203和R203引物对中F203的核苷酸序列是如SEQ ID No.7所示的正向引物序列，R203的核苷酸序列是如SEQ ID No.8所示的正向引物序列，所述F208和R208引物对中F202的核苷酸序列是如SEQ ID No.9所示的正向引物序列，R208的核苷酸序列是如SEQ ID No.10所示的正向引物序列，所述F213和R213引物对中F213的核苷酸序列是如SEQ ID No.11所示的正向引物序列，R213的核苷酸序列是如SEQ ID No.12所示的正向引物序列；PCR反应体系为10μL：10ng.μL^‑1的DNA模板1μL、2X Taq plus PCR Master Mix 5μL、10μmol·L^‑1的正反向引物各0.1μL以及ddH₂O共10μL；PCR扩增程序采用Touchdown模式：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s；每个循环降低0.5℃；72℃延伸30s，15个循环；95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，20个循环；72℃延伸10min，4℃保存；步骤(3)所述将PCR扩增产物进行毛细管电泳的方法是：取PCR产物0.3μL、GS‑500LIZ分子量内标0.5μL和去离子甲酰胺9.5μL混合加入PCR板，95℃变性5min，4℃冷却后离心，1×Buffer缓冲液上机检测；采用3730xl DNA测序仪进行毛细管电泳：预电泳15kV下3min；1.6kV下进样15s；电泳15kV下20min；步骤(4)所述的鉴别方法是：采用GenemarkerZ.2.0软件进行数据整理和图像分析，根据每对SSR引物的峰值，组合形成白蜡新品种‘金箭’的SSR指纹图谱；其中，F186和R186引物对的峰值为93/99，F187和R187引物对的峰值为134/140，F202和R202引物对的峰值为109/112，F203和R203引物对的峰值为157，F208和R208引物对的峰值为139/145，F213和R213引物对的峰值为81/90/96。