[发明专利]一种基于PD-1/PDL-1阻断功能及生物效应的抗癌药物快速筛选方法

摘要

本发明建立了一种基于PD‑1/PDL‑1阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法：将红色荧光蛋白RFP接于PDL‑1蛋白C端，构建PDL‑1‑RFP融合蛋白；将抗CD3的抗体通过一个人工跨膜节段偶联于MHC II蛋白下游，构建MHCII‑antiCD3融合蛋白；将人源PD‑1基因构建在高表达启动子CMV的下游，后续连接T细胞核因子转录应答元件与TATA‑Like Promoter以及绿色荧光蛋白基因d2EGFP，构建慢病毒载体，并建立高表达PD1的CMV_PD1.NFAT_d2EGFP/Jurkat稳转细胞系，以PDL‑1‑RFP与细胞系的亲和进行荧光检测筛选阻断剂。本方法可精确反映抗PD‑1或抗PDL‑1药物的PD‑1/PDL‑1阻断功能以及通过对PD‑1/PDL‑1的阻断作用对NFAT信号通路产生的生物学效应，判断其是否可以提高T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。

主权项

1.一种基于PD‑1/PDL‑1阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法，包括以下步骤：1)将红色荧光蛋白RFP接于PDL‑1蛋白C端，构建PDL‑1‑RFP融合蛋白；2)将抗CD3的抗体通过一个人工跨膜节段TLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAV偶联于MHC II蛋白下游，构建MHCII‑antiCD3融合蛋白；3)将绿色荧光蛋白基因d2EGFP构建在T细胞核因子转录应答元件与TATA‑Like Promoter的下游，将人源PD‑1基因构建在高表达启动子CMV的下游，构建慢病毒载体pCMV_PD1.NFAT_d2EGFP；4)将pCMV_PD1.NFAT_d2EGFP与质粒pH1、pH2共转染至慢病毒包装系细胞293V，收集CMV_PD1.NFAT_d2EGFP慢病毒并转染Jurkat，筛选构建高表达PD1的CMV_PD1.NFAT_d2EGFP/Jurkat稳转细胞系；5)将抗PD‑1或抗PDL‑1的单抗药、小分子、或多肽阻断剂等新药与CMV_PD‑1.NFAT_d2EGFP/Jurkat细胞共孵育后加入PDL‑1‑RFP融合蛋白和MHC‑CD3抗体融合蛋白孵育；清洗去除非特异性结合后检测CMV_PD‑1.NFAT_d2EGFP/Jurkat细胞表面的红色荧光蛋白RFP荧光值，判断抗PD1或抗PDL‑1药的PD‑1/PDL‑1阻断功能；或处理细胞后检测分析CMV_PD‑1.NFAT_d2EGFP/Jurkat细胞内的绿色荧光蛋白d2EGFP荧光值，判断该抗PD1药通过对PD‑1/PDL‑1的阻断作用对NFAT信号通路产生的生物学效应，是否可以提高T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。