[发明专利]一种成熟脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法

摘要

本发明公开了一种成熟脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法，涉及酒配方技术领域，其包括如下步骤：步骤Ⅰ、确定自噬相关蛋白A存在乙酰化修饰，先进行培养脂肪细胞，并诱导其分化为成熟脂肪细胞，后给予去乙酰化酶抑制剂处理。该成熟脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法，在预测的基础上进行乙酰化位点鉴定并得出乙酰化修饰点的具体位置，通过对乙酰化修饰位点重新定位与评估，使乙酰化修饰位点的鉴定更准确、更可信，因而可极大地提高检索结果的可信度，随后又进行乙酰化位点功能研究，且研究过程是采用病毒感染的方式，因而可在一定程度上缩短研究实验所消耗的时间，方法可靠，具有良好的重复性。

主权项

1.一种成熟脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤Ⅰ、确定自噬相关蛋白A存在乙酰化修饰先进行培养脂肪细胞，并诱导其分化为成熟脂肪细胞，后给予去乙酰化酶抑制剂处理，最后采用免疫沉淀(IP)的方法确定蛋白A存在乙酰化修饰；步骤Ⅱ、质谱分析或软件预测蛋白A可能的乙酰化位点步骤Ⅲ、乙酰化位点鉴定工具细胞：常用293T细胞进行乙酰化位点鉴定，构建乙酰化位点突变的质粒，转染293T细胞，采用IP的方法观察位点突变后蛋白A的乙酰化水平变化；成熟脂肪细胞：构建乙酰化位点突变的慢病毒，感染成熟脂肪细胞，采用IP的方法观察位点突变后蛋白A的乙酰化水平变化；步骤Ⅳ、乙酰化位点功能研究自噬相关蛋白A的功能主要研究其对自噬的影响，后续对各条通路研究针对不同动物模型、疾病具体进行；自噬相关蛋白A的过表达慢病毒和乙酰化位点突变的过表达慢病毒分别感染成熟脂肪细胞；透射电镜观察自噬小体的变化；同时感染GFP‑LC3慢病毒，共聚焦荧光显微镜观察GFP‑LC3点状聚集的情况；Western blot检测自噬标志蛋白LC3的表达变化；给予羟氯喹处理后，再次通过Western blot检测自噬标志蛋白LC3的表达变化，即是利用自噬通量的方法检测对自噬的影响。