[发明专利]一种发根农杆菌介导的菠菜毛状根遗传转化体系

摘要

一种发根农杆菌介导的菠菜毛状根遗传转化的方法。主要包括使用发根农杆菌侵染菠菜外植体后产生毛状根，再诱导菠菜毛状根产生愈伤，通过愈伤分化，获得菠菜毛状根的再生株。此外，本发明实现了发根农杆菌的Ri质粒与携带外源基因的Ti质粒的共转化，PCR结果和荧光显微镜观察显示,发根农杆菌Ri质粒的rol B基因以及Ti质粒中GFP基因已在菠菜毛状根基因组中稳定表达。

主权项

1.一种诱导菠菜毛状根及其培养和再生的方法，其特征包括以下步骤如下：（1）活化农杆菌当菌液浓度OD₆₀₀值到达0.6到0.8之间时，离心富集菌体。后用液体侵染液(SH基础培养基，100 μmol·L^‑1乙酰丁香酮，15 g·L^‑1蔗糖)重悬菌液至OD₆₀₀值等于0.3。（2）取菠菜叶、叶柄和茎取20‑35天的菠菜无菌苗，将菠菜的无菌苗叶片剪成大小约5 mm×5 mm的小段，菠菜的叶柄和茎剪成长约为5 mm小段，作为诱导菠菜毛状根的外植体。（3）将已经剪好的外植体置于侵染液中，振荡孵育5分钟后晾干。在共培养培养基上(SH基础培养基，15 g·L^‑1蔗糖，7.8 g·L^‑1琼脂，100 μmol·L^‑1乙酰丁香酮)共培养2天，后转移到毛状根培养培养基(SH基础培养基，15 g·L^‑1蔗糖，7.8 g·L^‑1琼脂，300 mg·L^‑1特美汀)。（4）菠菜外植体产生毛状根后，继代培养基同上(SH基础培养基，15 g·L^‑1蔗糖，7.8 g·L^‑1琼脂，300 mg·L^‑1特美汀)，20‑40天毛状根可以稳定增殖生长，每14天继代一次。（5）取处于稳定生长的菠菜毛状根置于愈伤诱导培养基(SH基础培养基，30 g·L^‑1蔗糖，7.8 g·L^‑1琼脂，4 mg·L^‑1 2,4‑D，1 mg·L^‑1 6‑BA，300 mg·L^‑1特美汀)，20天继代1次。（6）将毛状根产生的愈伤用镊子轻剥，继代在分化培养基(SH基础培养基，30 g·L^‑1蔗糖，7.8 g·L^‑1琼脂，2 mg·L^‑1 6‑BA，300 mg L^‑1特美汀)。在27 ℃下，光周期为8小时光照，16小时黑暗，培养30‑40天。（7）将菠菜丛生芽分开，继代在生根培养基上(1/2 MS基本培养基，15 g·L^‑1蔗糖，7.8 g·L^‑1琼脂)。在27 ℃下，光周期为8小时光照，16小时黑暗，培养10‑20天直至菠菜生根。