[发明专利]一种双荧光筛选β-丙氨酸合成酶的方法

摘要

本发明公开了一种双荧光法筛选β‑丙氨酸合成酶的方法，将荧光报告基因与β‑丙氨酸合成酶基因共同导入宿主菌中，接种含阿拉伯糖的基本盐培养基，在30～37℃诱导培养后，获得发酵液；取发酵液冻融破胞，取破胞液即为粗酶液；取粗酶液加入L‑天冬氨酸，于37℃条件下静置2h进行转化反应将底物转化为β‑丙氨酸，取转化液在吸收波长355nm和发射波长445nm的条件下测定荧光值；取发酵液在吸收波长395nm和发射波长509nm的条件下测定荧光值，筛选获得高活力β‑丙氨酸合成酶；本发明体系操作简便、酶活测量稳定、酶活检测灵敏度高等优点，在β‑丙氨酸合成酶定向改造方面具重要的应用价值。

主权项

1.一种双荧光筛选β‑丙氨酸合成酶的方法，其特征在于所述方法为：将荧光报告基因与β‑丙氨酸合成酶基因共同导入宿主菌中，接种含阿拉伯糖的基本盐培养基，在30～37℃诱导培养后，获得发酵液；取发酵液冻融破胞，破胞液即为粗酶液；取粗酶液加入L‑天冬氨酸，于37℃条件下静置2h进行转化反应，取转化液在吸收波长355nm和发射波长445nm的条件下测定荧光值，记为R₁；取发酵液在吸收波长395nm和发射波长509nm的条件下测定荧光值，记为R₂；根据公式(1)计算β‑丙氨酸合成酶的比活力，筛选获得β‑丙氨酸合成酶；所述宿主菌为β‑丙氨酸合成酶基因缺陷大肠杆菌；R₁：转化液在激发波长355nm和发射波长445nm条件下测得的荧光发射强度；R₂：发酵液在激发波长395nm和发射波长509nm条件下测得的荧光发射强度；V₁：L‑天冬氨酸向β‑丙氨酸转化检测反应中加入终浓度50g/L L‑天冬氨酸体积；V₂：在激发波长355nm和发射波长445nm条件下检测荧光发射强度时加入的粗酶液体积；V₃：L‑天冬氨酸向β‑丙氨酸转化检测反应中加入的转化液体积；V₄：在激发波长395nm和发射波长509nm条件下检测荧光发射强度时加入的发酵液体积。