[发明专利]一种从婴儿粪便中分离乳糖酶的方法

摘要

本发明公开了一种从婴儿粪便中分离乳糖酶的方法，步骤是溶解粪便样品、收集可溶性蛋白质；加入硫酸铵，冰浴，离心，去除漂浮物，收集液体；再加入氯仿抽提与蛋白质络合的油脂，利用高速离心收集沉淀；再加入磷酸盐缓冲液溶解沉淀并透析获得产物命名为粗酶液I；粗酶液I经过冷冻干燥、磷酸盐缓冲液溶解后得粗酶液II；粗酶液II经过阴离子交换色谱和凝胶过滤层析纯化，即获得初步纯化的乳糖酶。本发明方法易操作、目标产物得率高，有利于后续新型乳糖酶的质谱鉴定，酶产物可应用于食品生产领域。

主权项

1.一种从婴儿粪便中分离乳糖酶的方法，以如下比例量、条件和步骤实施：(1)取新鲜婴儿粪便样品10g，加入100mL预冷的无菌水，在冰浴环境下间歇搅拌20min，使样品中的蛋白质充分溶解在无菌水中，得到混悬液；(2)将混悬液加入50mL离心管中，6000±500rpm/min离心5±2min，小心收集上清液；离心管中剩余的膏状物再次9000±500rpm/min离心5±2min，小心收集上清液；离心管中剩余的膏状物再次12000±500rpm/min离心5±2min，小心收集上清液；将三次收集的上清液混合，得到总上清液；(3)向步骤(2)中的总上清液中加入硫酸铵，去除液体表面的漂浮物，收集剩余液体；(4)向步骤(3)中收集的剩余液体中加入氯仿，去除油脂，收集沉淀物；(5)向步骤(4)的沉淀物中加入50mL、100mM、pH7.0的磷酸盐缓冲液，在冰浴环境中至沉淀完全溶解，然后用孔径为30kDa的透析袋过夜透析，产物命名为粗酶液I，透析液为100mM、pH 7.0的磷酸盐缓冲液；(6)粗酶液I经过冷冻干燥后，加入2mL、100mM、pH7.0的磷酸盐缓冲液即制得粗酶液II；(7)粗酶液II经过阴离子交换色谱和凝胶过滤层析纯化，即获得初步纯化的乳糖酶；其特征在于，步骤(3)所述向步骤(2)中的总上清液中加入硫酸铵，去除液体表面的漂浮物，收集剩余液体的方法是：向步骤(2)中的总上清液中加入质量浓度为80±10％的硫酸铵，待充分溶解后冰浴10±2小时，然后12000±1000rpm/min离心20±5分钟，去除液体表面的漂浮物，收集剩余液体；步骤(4)所述向步骤(3)中收集的剩余液体中加入氯仿，去除油脂，收集沉淀物的方法是：向步骤(3)中收集的剩余液体中加入氯仿，二者体积量比为1:1±0.1，利用氯仿提取与蛋白质络合的油脂，待加入的氯仿充分涡旋混匀后，以12000±1000rpm/min离心20±5分钟，收集沉淀物；步骤(7)所述阴离子交换色谱采用GE公司型号为HiTrap Q HP的色谱柱；所述凝胶过滤层析采用GE公司型号为Sephadex G200的凝胶过滤层析柱。