[发明专利]一种通过转化凡纳滨对虾抗菌肽pen3基因提高浮萍及其液体培养基抗菌能力的方法在审

专利信息
申请号: 201910077081.8 申请日: 2019-01-27
公开(公告)号: CN109811003A 公开(公告)日: 2019-05-28
发明(设计)人: 孙金生;杨琳;曾键尧;李娜 申请(专利权)人: 天津师范大学
主分类号: C12N15/82 分类号: C12N15/82;A01H5/00;A01H4/00;A01G31/00
代理公司: 天津创智天诚知识产权代理事务所(普通合伙) 12214 代理人: 王秀奎
地址: 300387 *** 国省代码: 天津;12
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摘要: 发明公开了一种通过转化凡纳滨对虾抗菌肽pen3基因提高浮萍及其液体培养基抗菌能力的方法,本发明以浮萍为材料,利用浮萍转化体系对浮萍进行转基因,筛选得到转化凡纳滨对虾抗菌肽基因pen3的浮萍。经分子生物学鉴定,浮萍基因组DNA具有pen3基因。培养浮萍后的液体培养基和浮萍提取液均具有抑菌能力。本项发明的成套浮萍表达抗菌肽系统不仅完成了基因转化,而且液体培养基也具有抗菌能力,液体培养基添加到水塘后,是虾蟹培养过程中非常重要和实用的抑菌途径,还具备避免鱼虾等水生生物抗生素使用量过高的问题,是鱼虾免疫应用研究中不可缺少的关键操作。
搜索关键词: 浮萍 液体培养基 凡纳滨对虾 抗菌能力 抗菌肽 抑菌 基因 鱼虾 转化 分子生物学鉴定 抗菌肽基因 基因组DNA 关键操作 基因转化 水生生物 应用研究 转化体系 提取液 转基因 虾蟹 抗生素 水塘 筛选
【主权项】:
1.一种通过转化凡纳滨对虾抗菌肽pen3基因提高浮萍及其液体培养基抗菌能力的方法,其特征在于该方法的步骤包括:(1)获得浮萍愈伤组织:获得浮萍愈伤组织:无菌环境下,切除在液体培养基上培养的浮萍的假根,后横切浮萍的叶状体,利用愈伤诱导培养基对其进行愈伤组织的诱导,再利用再培培养基对浮萍愈伤进行愈伤继代,昼夜周期为16/8小时/天,光强66μmolm‑2s‑1,21℃下培养愈伤组织21天;(2)浮萍愈伤组织的转化:1)用穿刺法从甘油冻存管中沾取菌液,利用农杆菌固体培养基平板活化携带有凡那滨对虾抗菌肽pen3表达载体的农杆菌2次;2)利用10ml农杆菌液体培养基对农杆菌进行小体积扩繁;3)取步骤2)扩繁好的农杆菌菌液1ml移至40ml加有相应抗生素抗性(kana 50μg/ml+str 50μg/ml+rif20μg/ml)的农杆菌液体培养基中,28℃培养箱对其进行振荡培养7~11h,测定菌液在600纳米下的OD值,OD600为0.42~0.82之间时停止培养;4)对步骤3)获得的菌液进行常温离心,5000g 6min,收集沉淀下来的菌体5)利用转化培养液溶解菌体(共培养液成分为B5液体培养基+1%蔗糖+0.2%Tween 20);6)用消毒后的镊子在超净台无菌条件下夹取浮萍愈伤组织,将其转移至转化培养菌液内,室温下抽真空3次,每次1分钟;7)28℃缓慢振荡共培养30min;8)将共培养液体吸出,将外植体置于滤纸上待菌液彻底被吸干后,将愈伤组织移至固体共培养培养基上;9)固体共培养1~3d,长出菌圈后,用无菌水(含300mg/L头孢霉素)清洗愈伤组织3~5次,滤纸吸干后,移至筛选培养基(继代培养基+30mg/L潮霉素+300mg/L头孢霉素)上;10)筛选20d后,将愈伤组织移至再生培养基(含潮霉素0.5mg/L,头孢霉素300mg/L)上;11)20天浮萍再生成功后,将浮萍移至DATKO液体培养基(含潮霉素1mg/L)中。
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