[发明专利]一种通过RNAi沉默CREB1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pFYJN-1

摘要

一种通过RNAi沉默CREB1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pFYJN‑1，属于基因工程技术领域，其特征在于：设计最优靶向CREB1的干扰片段，其核苷酸序列如Seq ID No:1所示，构建靶向CREB1的shRNA干扰表达载体，命名为pFYJN‑1，转染肺癌细胞，通过qRT‑PCR、Western blot和Odyssey双红外激光成像系统检测RNAi后的CREB1和MRP1基因mRNA、蛋白的表达水平和蛋白条带变化并分析结果；流式细胞术检测细胞Rho123外排，结果显示：敲低CREB1的表达能下调MRP1基因的表达，且肺癌细胞Rho123外排减弱，药物潴留量增加，逆转肺癌细胞MDR。

主权项

1.一种通过RNAi沉默CREB1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pFYJN‑1，其特征在于：一种通过RNAi沉默CREB1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pFYJN‑1，首先复苏和培养A549/DDP细胞，接着根据NCBI中人NM号为134442.4的CREB1基因()的mRNA序列，按照RNAi设计原则，设计最优靶向CREB1的干扰片段：GCCGGGTACTACCATTCTACA；分析质粒pRNAT‑H1.1/Shuttle‑RFP的多克隆位点，在5’端加上BamHⅠ酶切位点，3’端加上HindⅢ酶切位点，经NCBI Blast比对同源性确定与其他基因无同源性，送至上海生工合成，命名为pFYJN‑1；在上述序列的基础上，加上序列为CGAA的LOOP环，反向互补序列及酶切位点，组成完整的RNAi干扰序列，以合成上下游引物的方式分别合成，用T₄DNA连接酶连接酶切载体与目的片段，连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中；挑取单个菌落并进行富集培养，提取重组载体质粒，构建靶向CREB1的shRNA干扰表达载体，待细胞生长至汇合度为60％左右时开始转染A549/DDP细胞，通过qRT‑PCR检测RNAi后的CREB1和MRP1基因mRNA的表达水平，通过Western blot检测RNAi后的CREB1和MRP1蛋白表达水平，使用Odyssey双红外激光成像系统检测蛋白条带变化并分析结果；流式细胞术检测细胞Rho123外排，结果显示，敲低CREB1的表达能下调MRP1基因的表达，且肺癌A549/DDP细胞Rho123外排减弱，药物潴留量增加，逆转肺癌细胞MDR。