[发明专利]一种利用固定化黄芪细胞生产黄芪活性成分的方法

摘要

本发明提供了一种利用固定化黄芪细胞生产黄芪活性成分的方法，该方法是通过黄芪外植体的消毒、愈伤组织的诱导与增殖、黄芪细胞的悬浮与分散、黄芪细胞的固定化、固定化细胞的磁场处理以及固定化细胞的培养这一技术流程实现的。本发明在黄芪细胞悬浮培养的基础上采用包埋材料对其进行固定化，再利用生物反应器在特定条件下培养经过磁化的固定化细胞以获得含有黄芪活性成分的培养液，培养液中黄芪多糖的含量高达68.7mg/g，黄芪皂苷的含量高达42.9mg/g，显著高于常规的黄芪细胞悬浮培养，并且固定化细胞还可以重复利用。本发明为黄芪活性成分的获得提供了新途径，也为黄芪活性成分的大规模工业化生产提供理论与技术基础。

主权项

1.一种利用固定化黄芪细胞生产黄芪活性成分的方法，其特征在于，该方法的技术流程如下：1）黄芪外植体的消毒：选取黄芪幼嫩的茎段作为外植体，用自来水冲洗10~20min，在无菌条件下先用75%乙醇消毒30s，再用0.1%升汞消毒3min，最后用无菌水冲洗4~5次，滤纸吸干水分，获得无菌的黄芪外植体；2）愈伤组织的诱导与增殖：将黄芪外植体切成0.5~0.7cm长的小段接种于含诱导培养基的培养皿上，置于25±1℃、黑暗条件下培养诱导出愈伤组织，选择生长良好的愈伤组织接种于含增殖培养基的三角瓶中，在相同条件下进行继代增殖培养，每21d继代1次；3）黄芪细胞的悬浮与分散：继代2~3次后挑选出生长旺盛、质地较为疏松的愈伤组织，接入含100mL悬浮培养基的500mL三角瓶中摇床振荡培养，培养条件为25±1℃、黑暗、转速100~120r/min，每14d 继代1次，继代3~4次逐渐形成稳定的黄芪细胞悬浮培养系，采用酶解法对黄芪细胞进行分散，然后将细胞悬浮液依次用0.9mm和0.1mm的筛网进行过滤，取滤液进行固定化操作；4）黄芪细胞的固定化：配制浓度为40g/L的无菌海藻酸钠溶液，并添加0.1%（W/V）的鼠李糖脂和2%（W/V）的Fe3O4，将步骤3）的滤液与此海藻酸钠溶液混合均匀，用注射器将混合液逐滴滴入浓度为20g/L的无菌CaCl2溶液中，在磁力搅拌器的搅拌下形成直径约为3mm的固定化凝胶珠，静置30min后放入冰箱过夜，取出用生理盐水洗涤2~3次；5）固定化细胞的磁场处理：将固定化凝胶珠置于无菌三角瓶中，放入磁场强度为500Gs的低强磁场中处理30min；6）固定化细胞的培养：使用气升式生物反应器进行培养，在无菌条件下，将磁化后的固定化凝胶珠以10%的接种量接入生产培养基中，装液量为50~60%，通气量为0.10~0.15VVM，温度为25±1℃，在培养的第8d接入5%的芽孢杆菌混悬液，100μmol/L的硫氢化钠，继续培养6‑8d后放出培养液，用于黄芪活性成分（黄芪多糖和黄芪皂苷）的分离纯化。