[发明专利]T细胞特异接头蛋白SLP-76类泛素化的方法及相应的体外高效鉴定

摘要

本发明公开了一种T细胞特异接头蛋白SLP‑76类泛素化的方法，包括以下步骤：构建SLP‑76‑UBC9融合表达质粒；提供SLP‑76羧基端改造质粒；将改造质粒与SUMO1表达质粒在HEK 293T细胞内共表达。本发明还同时提供了一种T细胞特异接头蛋白SLP‑76类泛素化的检测方法，包括以下步骤：取待测细胞加入裂解缓冲液；于冰上放置后离心；用蛋白聚丙烯酰氨凝胶电泳分离蛋白，转膜，孵育SUMO1特异性地抗体和标签蛋白/SLP‑76蛋白抗体；匹配蛋白条带位置，判定SLP‑76是否发生了类泛素化修饰。本发明确保SLP‑76类泛素化修饰鉴定的特异性、高效性和正确性，可重复性好。

主权项

1.T细胞特异接头蛋白SLP‑76类泛素化的方法，其特征在于包括以下步骤：1)、构建SLP‑76‑UBC9融合蛋白表达质粒：将编码SLP‑76蛋白的序列插入pcDNA3‑MCS‑Ubc9质粒的多克隆位点内，从而构建SLP‑76‑UBC9融合表达质粒；编码SLP‑76‑UBC9融合蛋白的序列为：ATGGCACTGAGGAATGTGCCCTTTCGCTCAGAGGTCCTGGGCTGGGACCCCGACAGCCTTGCTGACTATTTCAAGAAGCTCAACTATAAGGACTGTGAGAAGGCAGTGAAGAAGTACCACATCGATGGGGCTCGCTTCTTGAACCTGACAGAAAATGACATCCAGAAGTTCCCCAAGCTCCGGGTGCCGATTCTCAGTAAGTTAAGTCAGGAAATCAACAAGAACGAAGAGAGGAGGAGCATCTTCACACGCAAACCCCAAGTCCCGCGGTTTCCTGAAGAGACAGAAAGCCACGAAGAGGACAATGGGGGCTGGTCGTCCTTTGAAGAAGACGATTATGAAAGTCCCAATGATGACCAGGATGGGGAGGATGATGGAGACTATGAGTCCCCCAATGAGGAGGAAGAGGCACCCGTGGAAGATGACGCGGATTATGAGCCGCCACCCTCCAATGACGAGGAAGCTCTGCAGAACTCCATCCTGCCTGCCAAGCCTTTCCCCAACTCCAACTCCATGTACATCGACCGGCCCCCCTCTGGGAAAACCCCCCAGCAGCCTCCTGTGCCCCCCCAGAGACCGATGGCCGCCCTCCCGCCCCCACCAGCCGGCCGGAATCACTCGCCACTGCCCCCACCCCAGACCAACCACGAAGAACCCAGCAGAAGCAGAAACCACAAAACGGCAAAGCTCCCTGCTCCTTCAATAGACAGAAGCACGAAACCTCCCCTAGATCGTTCATTAGCTCCGTTTGATAGAGAACCCTTCACACTAGGAAAGAAACCACCATTTTCTGACAAGCCCTCGATTCCAGCGGGAAGGTCACTCGGGGAGCATTTACCCAAGATTCAAAAGCCTCCTTTACCACCGACCACGGAAAGACATGAAAGGAGCAGCCCCCTGCCAGGGAAGAAGCCACCTGTGCCAAAGCATGGATGGGGACCAGACAGAAGAGAGAATGATGAAGATGATGTGCATCAGAGACCTTTGCCCCAGCCAGCACTACTTCCTATGAGCTCCAACACTTTCCCTTCAAGATCTACTAAGCCAAGTCCCATGAACCCTCTCCCATCCTCTCACATGCCTGGAGCATTCTCAGAAAGTAACAGCAGTTTTCCACAGAGTGCCTCCCTGCCACCATACTTCTCTCAAGGCCCTAGCAACAGACCACCTATCAGAGCCGAAGGCAGAAACTTCCCCTTGCCACTTCCAAACAAACCTCGGCCCCCATCCCCCGCGGAGGAAGAGAATTCATTAAATGAAGAGTGGTACGTTTCTTATATTACCCGACCAGAGGCAGAAGCTGCTCTTAGAAAGATAAACCAGGATGGCACATTTCTGGTCAGAGACAGCTCTAAAAAAACAACAACCAATCCATATGTCCTCATGGTGTTGTACAAAGATAAAGTTTACAACATCCAGATCCGTTATCAGAAGGAAAGTCAAGTTTACTTGTTGGGAACTGGACTCCGAGGGAAAGAGGACTTTCTGTCTGTGTCAGATATTATTGACTACTTCAGGAAAATGCCACTTCTGCTCATTGATGGGAAAAACCGAGGTTCCAGATACCAGTGCACATTAACGCATGCTGCAGGGTACCCACGAGGAGGATCGGGGATCGCCCTCAGCCGCCTTGCGCAGGAAAGGAAAGCCTGGAGGAAGGACCACCCTTTTGGCTTTGTAGCTGTCCCAACAAAGAACCCTGATGGCACAATGAACCTGATGAACTGGGAGTGCGCTATCCCTGGAAAGAAGGGGACTCCATGGGAAGGAGGCTTGTTCAAGCTACGGATGCTTTTCAAAGATGACTATCCGTCCTCACCACCAAAATGTAAATTTGAGCCCCCACTGTTTCATCCAAACGTGTATCCTTCTGGCACAGTGTGCCTGTCCATCCTGGAGGAAGACAAGGACTGGAGGCCAGCTATCACCATCAAACAGATCTTATTAGGAATACAAGAACTTCTAAATGAACCAAATATTCAAGACCCAGCTCAAGCAGAGGCCTACACAATTTACTGCCAAAACAGAGTGGAATATGAGAAAAGGGTCCGAGCACAAGCGAAGAAGTTTGCCCCCTCATAA；2)、提供SLP‑76羧基端改造质粒；3)、将步骤2)所得的改造质粒与SUMO1表达质粒在HEK 293T细胞内共表达；得到SLP‑76类泛素化修饰蛋白。