[发明专利]鉴定sRNA与靶mRNA编码区域的作用关系的方法及检测系统

摘要

本发明属于物种基因测序技术领域，公开了一种鉴定sRNA与靶mRNA编码区域的作用关系的方法及检测系统，针对目的基因的启动子特异性设计4条特异性引物；获取pUC57质粒骨架；构建同源重组质粒；质粒提取；用提取的质粒对野生型Z.mobilis 8b进行电转化；阳性克隆验证；构建目的sRNA过表达菌株；确定作用对之间是否有相互作用。本发明提供的方法方便快捷，相比于传统的EMSA方法，操作简单；本发明基于流式细胞术的单荧光报告基因系统，能快速确定sRNA与靶基因编码区域之间是否存在相互作用关系，便于批量操作；也可以应用于除运动发酵单胞菌以外的其他物种中使用。

主权项

1.一种鉴定sRNA与靶mRNA编码区域的作用关系的方法，其特征在于，所述鉴定sRNA与靶mRNA编码区域的作用关系的方法包括：步骤一，利用生物信息学方法对靶基因的启动子序列进行分析，确定启动子序列；步骤二，针对目的基因的启动子特异性设计4条特异性引物，用于扩增得到上下游同源臂；步骤三，以Zymomonas mobilis ZM4 gDNA为模板，分别以引物1+引物2、引物3+引物4扩增得到上下游同源臂；步骤四，用含有筛选诱导功能区的质粒作为模板，扩增得到筛选诱导功能区片段；步骤五，以pUC57质粒为模板，PCR扩增得到质粒骨架；步骤六，将上下游同源臂和筛选诱导功能区通过overlap PCR连接成目的长片段，再通过Gibson装配将长片段与pUC57质粒骨架相连；步骤七，转化后PCR验证平板上的阳性克隆，过夜培养后提取其中的质粒；步骤八，用提取的质粒对野生型Z.mobilis 8b进行电转化；步骤九，待平板上长出单菌落后可进行一次划线传代培养，之后挑取单克隆进行PCR验证；将条带正确的菌株测序确认，确定序列无误后，制备感受态，用于后续实验；步骤十，将过表达目的sRNA的质粒通过上述电转化的方法转入上一步得到的opmCherry融合表达突变菌株，验证正确后即可得到体内含有目的sRNA‑coding region作用对的实验菌株；步骤十一，对得到的实验菌株采用流式细胞术进行荧光强度的测定，通过与对照组之间进行比较分析，确定作用对之间是否有相互作用。