[发明专利]一氧化氮合酶2基因过表达慢病毒、相应基因载体及其制备方法和应用在审
| 申请号： | 201910117363.6 | 申请日： | 2019-02-15 |
| 公开（公告）号： | CN109868280A | 公开（公告）日： | 2019-06-11 |
| 发明（设计）人： | 褚茂平;郭晓令;李超;陈显武 | 申请（专利权）人： | 温州医科大学附属第二医院;温州医科大学附属育英儿童医院 |
| 主分类号： | C12N15/66 | 分类号： | C12N15/66;C12N15/867;C12N9/02 |
| 代理公司： | 温州名创知识产权代理有限公司 33258 | 代理人： | 陈加利 |
| 地址： | 325000 浙江*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | 本发明涉及一种人源一氧化氮合酶2(NOS2)基因过表达慢病毒载体、NOS2基因过表达慢病毒及其构建方法和应用。本发明通过分子克隆技术，将普通质粒上的人源NOS2基因利用PCR扩增技术加上XhoI和BamHI酶切位点，并经酶切后连接到空载的过表达慢病毒载体上，得到NOS2基因过表达的慢病毒载体。再使用慢病毒包装质粒对NOS2基因过表达慢病毒载体进行包装，通过转染293T细胞，得到相应的慢病毒。本发明构建的NOS2基因过表达慢病毒对宿主细胞转染效率高，能特异性、持续、高效的促进人源NOS2基因在宿主细胞中稳定表达。同时，本发明构建的NOS2基因过表达慢病毒载体能特异性合成可诱导型一氧化氮合酶(iNOS)，并带有绿色荧光蛋白标签，为进一步研究人源一氧化氮合酶2(NOS2)的功能和潜在作用机理提供了实验基础。 | ||
| 搜索关键词： | 基因过表达 慢病毒载体 慢病毒 人源 一氧化氮合酶 构建 宿主细胞 可诱导型一氧化氮合酶 慢病毒包装质粒 制备方法和应用 分子克隆技术 绿色荧光蛋白 基因利用 实验基础 稳定表达 相应基因 转染效率 作用机理 再使用 空载 酶切 质粒 转染 标签 合成 细胞 基因 应用 研究 | ||
【主权项】：
1.一种人源一氧化氮合酶2基因过表达慢病毒载体的制备方法，其特征在于，所述人源一氧化氮合酶2基因为NOS2基因，所述制备方法包括以下步骤：①以普通质粒pDoubleEx‑EGFP‑NOS2为基因模板，通过上游引物NOS2‑F和下游引物NOS2‑R对该模板进行PCR扩增获得NOS2基因，此上下游引物两端分别预先设计加入XhoI和BamHI酶切位点序列，所述NOS2‑F的上游引物序列为：CACCTCGAGATGGCCTGTCCTTGGAAATTTCTGT，NOS2‑R的下游引物序列为：GCGAGATCTTCAGAGCGCTGACATCTCCAG；②确认步骤①中的PCR产物大小为3462bp后回收纯化的NOS2基因；③用XhoI限制性内切酶和BamHI限制性内切酶分别对所述纯化的NOS2基因和空载的过表达慢病毒载体pLVX‑IRES‑ZsGreen1进行双酶切后，回收纯化带有酶切粘性末端的NOS2基因和pLVX‑IRES‑ZsGreen1；④采用T4 DNA连接酶将NOS2基因连接到pLVX‑IRES‑ZsGreen1上，得到NOS2基因过表达的慢病毒载体pLVX‑IRES‑ZsGreen1‑NOS2。
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