[发明专利]猪流行性腹泻病毒重组S2蛋白及其多克隆抗体的制备方法

摘要

本发明公开了一种猪流行性腹泻病毒重组S2蛋白的制备方法，该法对PEDV S2A基因片段进行扩增后经过原核表达、纯化后获得重组S2蛋白。据此，发明人还建立了重组S2蛋白多克隆抗体的制备方法，即应用猪流行性腹泻病毒重组S2蛋白与弗氏佐剂乳化后免疫动物获得多克隆抗体血清。实验表明，本发明成功扩增了PEDV流行变异毒株CH/GX/2015/750A S2基因部分抗原性强的区域，并进行原核表达，初步研究其反应原性和免疫原性，为下一步开展S2蛋白的功能研究以及为诊断试剂盒或亚单位疫苗的研发奠定了基础。

主权项

1.一种猪流行性腹泻病毒重组S2蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：<1>PEDV S2A基因片段的扩增对PEDV的RNA进行反转录获得cDNA，然后采用特异性引物S2A‑P1和S2A‑P2对PEDV S2A基因进行PCR扩增，所述特异性引物S2A‑P1和S2A‑P2分别具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列；<2>原核表达质粒pET32a‑S2A的构建将PCR扩增得到的PEDV S2A基因片段连接pMD18‑T克隆载体，转化DH5α感受态细胞获得pMD18‑S2A克隆质粒；将pMD18‑S2A克隆质粒和pET‑32a(+)分别进行双酶切，回收S2A基因和pET‑32a(+)载体，利用T4连接酶将pET‑32a(+)和S2A基因连接过夜后转化到DH5α感受态细胞后提取质粒得到原核表达质粒pET32a‑S2A；<3>重组S2蛋白的获取将原核表达质粒pET32a‑S2A转化BL21感受态细胞，加入IPTG诱导，菌液超声波裂解，离心，收集上清和沉淀，SDS‑PAGE电泳确定重组S2蛋白主要在上清中表达，按照康为世纪公司His标签蛋白纯化试剂盒的纯化方法获得重组S2蛋白。