[发明专利]一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法

摘要

本发明公开了一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，包括步骤一，采集脂肪；步骤二，脂肪除杂；步骤三，混酶消化；步骤四，收集离心；步骤五，培养传代；步骤六，消化冻存；该人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，采用混合酶分离，消化时间短，所得到的细胞不需要淋巴细胞分离液和过滤网的进一步纯化，只需在细胞贴壁之后换液即可，此方法分离过程成本低；分离操作，所使用的试剂物料少，操作流程简化，减少操作过程中的污染风险；整个分离和培养过程中均无使用动物源血清，降低细胞毒性；采用的混合酶和无血清培养体系的组成及配方使得培养周期短。

主权项

1.一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，包括步骤一，采集脂肪；步骤二，脂肪除杂；步骤三，混酶消化；步骤四，收集离心；步骤五，培养传代；步骤六，消化冻存；其特征在于：其中在上述步骤一中，采集脂肪包括以下步骤：1）采集人来源的脂肪2‑100ml，放入无菌储存运输液中；2）将采集的脂肪，消毒，清洗；其中在上述步骤二中，将消毒清洗后的脂肪组织，放入离心管中用眼科剪剪碎组织，加入4~10倍体积生理盐水，1500‑2000rpm离心5min离心后，将上层脂肪块吸取至离心管中加入生理盐水，再次洗涤离心；其中在上述步骤三中，混酶消化包括以下步骤：1）将上述步骤二中所得的脂肪组织中加入等体积的混合酶； 2）利用2ml移液器吹打分散脂肪团块，放入恒温恒湿CO2培养箱中，消化10‑30min；其中在上述步骤四中，将上述步骤三中所得脂肪组织收集并离心，得到细胞沉淀；其中在上述步骤五中，无血清培养包括以下步骤：1）利用红细胞裂解液破解红细胞，离心后得到白色细胞沉淀；2）用无血清培养体系重悬细胞，接种培养至恒温恒湿CO₂培养箱中；3）24‑40H后，可观察到大约20‑40%融合的长梭形贴壁细胞时换液；4）培养至第三天或第四天，细胞达到90%以上融合时，采用TrypLE™ Express进行消化；5）将所得的细胞按照1:3~1:8的比例进行传代，用无血清体系培养；其中在上述步骤六中，当培养的细胞达到90%以上融合时再采用TrypLE™ Express进行消化后冻存。