[发明专利]一种用于猪胰岛细胞的冻存复苏方法及冻存液和复苏液

摘要

本发明公开了一种用于猪胰岛细胞的冻存复苏方法及冻存液和复苏液。本方法是在冻存前，使用海藻酸钠包裹猪胰岛细胞，在不影响正常代谢水平的前提下，构成相对稳定三维附着空间，使其在冻存‑复苏过程后保障稳定的回收率(>60％)和胰岛素分泌功能，以达到建立胰岛细胞库的目的。

主权项

1.一种猪胰岛细胞团微胶囊的冻存-复苏方法，其特征在于，包括以下步骤：/n（1）制备胰岛细胞团微胶囊；/n具体包括如下步骤：/n1）将胰岛细胞团和海藻酸钠溶液混合制备微胶囊，混合液中胰岛细胞团浓度为5000-10000IEQ/mL，海藻酸钠浓度为0.5-10%；/n2）将胰岛细胞团微胶囊在50mM-200mM的氯化钙溶液中平衡至少30分钟后进行冻存;/n（2）采用冻存液对胰岛细胞团微胶囊进行冻存，所述的冻存液包括A液、B液，组成如下：A液为低浓度冻存液，含二甲基亚砜0.5-1.5M，乙二醇0.1-1M，过氧化氢酶10-100μg/mL，海藻糖0.1-1M，β-氨基乙磺酸1-10mM，猪血清30-80%体积百分比；B液为高浓度冻存液，含二甲基亚砜2.5-4.5M，乙二醇0.1-1M，过氧化氢酶10-100μg/mL，海藻糖0.1-1M，β-氨基乙磺酸1-10mM，猪血清30%-80%体积百分比；/n具体是将步骤（1）制备的胰岛细胞团微胶囊静置沉淀，弃上清；向弃尽上清的胰岛细胞团微胶囊中加入A液后平衡，再加入B液平衡；将胰岛细胞团微胶囊分装至冻存管中；分阶段降温后将细胞置于液氮中长期保存；/n（3）采用复苏液对冻存的胰岛细胞团微胶囊进行复苏，所述的复苏液包括C液、D液，组成如下：C液为复苏平衡液，含蔗糖0.75-1.50M，过氧化氢酶10-100μg/mL，β-氨基乙磺酸1-10mM，SD282 0.1-5mM，5-30%体积百分比人血白蛋白；D液为倍比稀释液，含过氧化氢酶10-100μg/mL，β-氨基乙磺酸1-10mM，SD282 0.1-3mM，人血白蛋白5-30%体积百分比，乳酸醛酸盐10-100mM；/n具体是在37°C快速溶解胰岛细胞团微胶囊，静置沉淀，弃冻存液上清；添加复苏平衡液C液平衡；再加入倍比稀释液D液平衡；静置沉淀，弃上清，加培养基培养。/n