[发明专利]A19布鲁氏菌GroES缺失突变株构建及应用

摘要

本发明是关于一种A19布鲁氏菌GroES缺失突变株构建与应用，属于布鲁氏菌疫苗研究领域。通过设计GroES的上、下游区域及kana抗性基因的PCR引物，扩增目的基因上、下游两个长度的同源性核苷酸片段及kana抗性基因，采用PCR扩增的方法将它们定向连接起来，得到目的基因缺陷型同源性核苷酸片段，将获得的目的基因缺陷型同源性核苷酸片段连接入克隆载体中，得到含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的重组载体，将构建的含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的重组载体转化布鲁氏菌A19，筛选阳性克隆，得到缺失目的基因的布鲁氏菌A19弱毒疫苗突变株。该疫苗突变株有望发展成为带标记的弱毒疫苗，对控制布病的流行、传播和国民经济的健康发展起到积极的促进作用。

主权项

1.A19布鲁氏菌GroES基因缺失突变株的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)设计引物：分别依据布鲁氏菌A19全基因组序列中靶基因GroES的上、下游区域的核苷酸序列，各设计一对特异的PCR引物，扩增目的基因上、下游两个长度分别为545bp和628bp的同源性核苷酸片段；依据pK19mobsacB质粒的kana抗性基因，设计一对引物，扩增得到974bp的kana抗性基因片段；所述扩增上游片段的正向引物和扩增下游片段的逆向引物的5’端分别添加一个限制性内切酶识别位点及其保护性碱基；2)目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的获得:以布鲁氏菌A19的基因组DNA为模板，分别在步骤1)设计的两对GroES基因的引物的引导下进行PCR扩增，得到两个同源性核苷酸片段；依pK19mobsacB质粒为模板，在步骤1)设计的一对kana基因的引物的引导下进行PCR扩增，得到两个同源性核苷酸片段；将扩增获得的GroES的上、下游同源性核苷酸片段和kana抗性基因片段采用PCR扩增的方法定向连接，构成GroES基因被kana抗性基因替换的同源性核苷酸片段；3)将步骤2)获得的目的基因缺陷型同源性核苷酸片段连接入克隆载体中，得到含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的重组载体；4)将步骤3)构建的含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的重组载体转化布鲁氏菌A19，筛选阳性克隆，得到缺失目的基因GroES的布鲁氏菌A19弱毒疫苗突变株。